GB/T 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数

[所属分类:GB/T 4789] [发布时间:2017-8-25] [发布人:管理员] [阅读次数:] [返回]

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
GB4789.3—2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验 大肠菌群计数
2 0 1 6 - 1 2 - 2 3发布 2 0 1 7 - 0 6 - 2 3实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
Ⅰ
前 言
本 标 准 代 替 GB4 7 8 9.3—2 0 1 0《 食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 微 生 物 学 检 验 大 肠 菌 群 计 数》、
GB /T4 7 8 9.3 2—2 0 0 2《 食品卫生微生物学检验 大肠菌群的快速检测》和 SN/T0 1 6 9—2 0 1 0《 进出口
食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》大肠菌群计数部分。
本标准与 GB4 7 8 9.3—2 0 1 0相比,主要变化如下:
— — —增加了检验原理;
— — —修改了适用范围;
— — —修改了典型菌落的形态描述;
— — —修改了第二法平板菌落数的选择;
— — —修改了第二法证实试验;
— — —修改了第二法平板计数的报告。GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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食品安全国家标准
食品微生物学检验 大肠菌群计数
1 范围
本标准规定了食品中大肠菌群(C o l i f o r ms)计数的方法。
本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数;第二法适用于大肠菌群含量较
高的食品中大肠菌群的计数。
2 术语和定义
2.1
大肠菌群 C o l i f o r m s
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2
最可能数 Mo s tp r o b a b l en u mb e r;MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 检验原理
3.1 MPN 法
MPN 法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。 待测样品经系列稀释并培养后,根据其未
生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
3.2 平板计数法
大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带
有沉淀环的菌落。
4 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
4.1 恒温培养箱:3 6 ℃ ±1 ℃。
4.2 冰箱:2 ℃~5 ℃。
4.3 恒温水浴箱:4 6℃±1℃。
4.4 天平:感量 0.1g。
4.5 均质器。
4.6 振荡器。
4.7 无菌吸管:1mL(具 0.0 1mL 刻度)、1 0mL(具 0.1mL 刻度)或微量移液器及吸头。
4.8 无菌锥形瓶:容量5 0 0mL。
4.9 无菌培养皿:直径 9 0mm。GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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4.1 0 pH 计或 pH 比色管或精密pH 试纸。
4.1 1 菌落计数器。
5 培养基和试剂
5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(l a u r y ls u l f a t et r y p t o s e, L ST)肉汤:见 A.1。
5.2 煌绿乳糖胆盐(b r i l l i a n tg r e e nl a c t o s eb i l e, BGLB)肉汤:见 A.2。
5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(v i o l e tr e db i l ea g a r, VRBA):见 A.3。
5.4 无菌磷酸盐缓冲液:见 A.4。
5.5 无菌生理盐水:见 A.5。
5.6 1mo l / LNa OH 溶液:见 A.6。
5.7 1mo l / LHC l溶液:见 A.7。
第一法 大肠菌群 MPN 计数法
6 检验程序
大肠菌群 MPN 计数的检验程序见图1。
图 1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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7 操作步骤
7.1 样品的稀释
7.1.1 固体和半固体样品:称取2 5g样品,放入盛有2 2 5mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯
内 ,80 0 0r /m i n~1 00 0 0r /m i n均质1m i n~2m i n,或放入盛有2 2 5mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无
菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n,制成1∶1 0的样品匀液。
7.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取2 5mL样品置盛有2 2 5mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶
(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制
成1∶1 0的样品匀液。
7.1.3 样品匀液的pH 应在6.5~7.5之间,必要时分别用1mo l / LNa OH 或1mo l / LHC l调节。
7.1.4 用 1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1∶1 0样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲
液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无
菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶1 0 0的样品匀液。
7.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。 每递增稀释
1次, 换用1支1mL无菌吸管或吸头。 从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过1 5m i n。
7.2 初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管
月桂基硫酸盐胰蛋白胨(L S T)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料 L S T 肉汤),3 6 ℃±
1 ℃ 培养2 4h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,2 4h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未
产气则继续培养至4 8h±2h,产气者进行复发酵试验。 未产气者为大肠菌群阴性。
7.3 复发酵试验(证实试验)
用接种环从产气的 L ST 肉汤管中分别取培养物1 环, 移种于煌绿乳糖胆盐肉汤( BGLB) 管中,
3 6 ℃±1 ℃培养4 8h±2h,观察产气情况。 产气者,计为大肠菌群阳性管。
7.4 大肠菌群最可能数(MPN)的报告
按7.3确证的大肠菌群 BGLB阳性管数,检索 MPN 表(见附录 B),报告每g(mL)样品中大肠菌群
的 MPN 值。
第二法 大肠菌群平板计数法
8 检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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图 2 大肠菌群平板计数法检验程序
9 操作步骤
9.1 样品的稀释
按7.1进行。
9.2 平板计数
9.2.1 选取2个~3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。 同时取1mL
生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
9.2.2 及时将1 5mL~2 0mL融化并恒温至4 6℃的结晶紫中性红胆盐琼脂( VRBA)约倾注于每个平
皿中。 小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA 覆盖平板表
层。 翻转平板,置于3 6 ℃±1 ℃培养1 8h~2 4h。
9.3 平板菌落数的选择
选取菌落数在1 5CFU~1 5 0CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落
(如菌落直径较典型菌落小)。 典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm
或更大,最低稀释度平板低于1 5CFU 的记录具体菌落数。
9.4 证实试验
从 VRBA 平板上挑取1 0个不同类型的典型和可疑菌落,少于1 0个菌落的挑取全部典型和可疑菌
落。 分别移种于 BGLB肉汤管内,3 6℃±1℃培养2 4h~4 8h,观察产气情况。 凡BGLB肉汤管产气,
即可报告为大肠菌群阳性。GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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9.5 大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以9.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每
g(mL) 样品中大肠菌群数。 例:1 0-4样品稀释液1mL,在 VRBA 平板上有1 0 0个典型和可疑菌落,挑
取其中1 0个接种BGL B肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:1 0 0×6 / 1 0×1 0 4/ g(mL)=
6.0×1 0 5CFU/ g(mL)。 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀
释倍数计算。GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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附 录 A
培养基和试剂
A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(L S T)肉汤
A.1.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 2 0.0g
氯化钠 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾(K 2HPO 4) 2.7 5g
磷酸二氢钾( KH2PO 4) 2.7 5g
月桂基硫酸钠 0.1g
蒸馏水 10 0 0mL
A.1.2 制法
将上述成分溶解于蒸馏水中,调节pH 至6.8±0.2。 分装到有玻璃小倒管的试管中,每管1 0mL。
1 2 1 ℃高压灭菌1 5m i n。
A.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤
A.2.1 成分
蛋白胨 1 0.0g
乳糖 1 0.0g
牛胆粉(o x g a l l或o x b i l e)溶液 2 0 0mL
0.1%煌绿水溶液 1 3.3mL
蒸馏水 8 0 0mL
A.2.2 制法
将蛋白胨、乳糖溶于约5 0 0 mL 蒸馏水中,加入牛胆粉溶液2 0 0 mL(将2 0.0g脱水牛胆粉溶于
2 0 0mL 蒸馏水中,调节pH 至7.0~7.5),用蒸馏水稀释到9 7 5mL,调节pH 至7.2±0.1,再加入0.1%
煌绿水溶液1 3.3mL,用蒸馏水补足到10 0 0mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管
1 0mL。1 2 1 ℃高压灭菌1 5m i n。
A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
A.3.1 成分
蛋白胨 7.0g
酵母膏 3.0g
乳糖 1 0.0gGB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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氯化钠 5.0g
胆盐或3号胆盐 1.5g
中性红 0.0 3g
结晶紫 0.0 0 2g
琼脂 1 5g~1 8g
蒸馏水 10 0 0mL
A.3.2 制法
将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节pH 至7.4±0.1。 煮沸2m i n,将培养基融
化并恒温至4 5 ℃~5 0 ℃倾注平板。 使用前临时制备,不得超过3h。
A.4 磷酸盐缓冲液
A.4.1 成分
磷酸二氢钾( KH2PO 4) 3 4.0g
蒸馏水 5 0 0mL
A.4.2 制法
贮存液:称取3 4.0g的磷酸二氢钾溶于5 0 0mL蒸馏水中,用大约1 7 5mL的1mo l / L氢氧化钠溶
液调节pH 至7.2±0.2,用蒸馏水稀释至10 0 0mL后贮存于冰箱。 稀释液:取贮存液1.2 5mL,用蒸馏
水稀释至10 0 0mL,分装于适宜容器中,1 2 1 ℃高压灭菌1 5m i n。
A.5 无菌生理盐水
A.5.1 成分
氯化钠 8.5g
蒸馏水 10 0 0mL
A.5.2 制法
称取8.5g氯化钠溶于10 0 0mL蒸馏水中,1 2 1 ℃高压灭菌1 5m i n。
A.6 1m o l / LN a OH 溶液
A.6.1 成分
Na OH 4 0.0g
蒸馏水 10 0 0mL
A.6.2 制法
称取4 0g氢氧化钠溶于10 0 0mL无菌蒸馏水中。GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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A.7 1m o l / LHC l溶液
A.7.1 成分
HC l 9 0mL
蒸馏水 10 0 0mL
A.7.2 制法
移取浓盐酸9 0mL,用无菌蒸馏水稀释至10 0 0mL。GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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附 录 B
大肠菌群最可能数(MPN)检索表
B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表
每g(mL)检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索见表 B.1。
表 B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表
阳性管数
0.1 0 0.0 1 0.0 0 1
MPN
9 5%可信限
下限 上限
阳性管数
0.1 0 0.0 1 0.0 0 1
MPN
9 5%可信限
下限 上限
0 0 0 <3.0 — 9.5 2 2 0 2 1 4.5 4 2
0 0 1 3.0 0.1 5 9.6 2 2 1 2 8 8.7 9 4
0 1 0 3.0 0.1 5 1 1 2 2 2 3 5 8.7 9 4
0 1 1 6.1 1.2 1 8 2 3 0 2 9 8.7 9 4
0 2 0 6.2 1.2 1 8 2 3 1 3 6 8.7 9 4
0 3 0 9.4 3.6 3 8 3 0 0 2 3 4.6 9 4
1 0 0 3.6 0.1 7 1 8 3 0 1 3 8 8.7 1 1 0
1 0 1 7.2 1.3 1 8 3 0 2 6 4 1 7 1 8 0
1 0 2 1 1 3.6 3 8 3 1 0 4 3 9 1 8 0
1 1 0 7.4 1.3 2 0 3 1 1 7 5 1 7 2 0 0
1 1 1 1 1 3.6 3 8 3 1 2 1 2 0 3 7 4 2 0
1 2 0 1 1 3.6 4 2 3 1 3 1 6 0 4 0 4 2 0
1 2 1 1 5 4.5 4 2 3 2 0 9 3 1 8 4 2 0
1 3 0 1 6 4.5 4 2 3 2 1 1 5 0 3 7 4 2 0
2 0 0 9.2 1.4 3 8 3 2 2 2 1 0 4 0 4 3 0
2 0 1 1 4 3.6 4 2 3 2 3 2 9 0 9 0 10 0 0
2 0 2 2 0 4.5 4 2 3 3 0 2 4 0 4 2 10 0 0
2 1 0 1 5 3.7 4 2 3 3 1 4 6 0 9 0 20 0 0
2 1 1 2 0 4.5 4 2 3 3 2 11 0 0 1 8 0 41 0 0
2 1 2 2 7 8.7 9 4 3 3 3 >11 0 0 4 2 0 —
注1: 本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.0 1g(mL)、0.0 0 1g(mL)],每个稀释度接种3管。
注2: 表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.0 1g(mL)时,表内数字应相应降低1 0倍;如改用0.0 1g
(mL)、0.0 0 1g(mL)和0.0 0 01g(mL)时,则表内数字应相应增高1 0倍,其余类推