口腔支原体（ATCC23714）和肺炎支原体（ATCC15531）的活化保种过程，通过学习和比较，总结了其中的一些注意事项；同时对中国药典和欧美药典在支原体培养上的一些差异进行比较，来和大家分享一下，互相学习，共同进步。
支原体活化和保种01 准备
这准备，是指整个实验开展前的学习准备。
因为0代的口腔支原体（ATCC 23714）和肺炎支原体（ATCC 15531）只能从ATCC购买，如果是第一次购买并尝试活化冻干支原体，那么把ATCC关于这两株菌的产品说明、检验报告、SDS等，甚至包括ATCC细菌学指南《ATCC Bacteriology_Guide》、2015版《中国药典》三部 3301《支原体检查法》、USP34 63《支原体检查法》、EP8.0《2.6.7. MYCOPLASMAS》等资料通读一遍是十分有必要的。
甚至还可以下载几本书，例如《支原体学》第2版、《支原体-医学微生物学》、《支原体与支原体病》等了解下支原体的一些基本情况。
在这一阶段最好能确定好活化冻干支原体的具体操作方法，然后去按方法去操作。
比如说：
是采用中国药典的支原体肉汤培养基和精氨酸支原体肉汤培养基，还是采用ATCC指定的ATCC 2611 培养基和ATCC 243培养基？
是采用甘油保藏法、还是直接分装法、还是冻干法进行保种呢？
在购买前先制定好计划，可以避免反复下单购买培养基或试剂，省时省力，有效避免遗漏。
02 购买
ATCC口腔支原体和肺炎支原体
确定好了，就可以下单进行购买。
为了让大家更好的了解差异，本次比较，同时采用了中国药典的配方培养基和ATCC指定的培养基进行活化。
因为只有采用ATCC的配方培养基，后续如果出问题，ATCC才会承认。但是ATCC的配方培养基成分比较复杂，一些成分要从国外采购，耗时费力，考虑到长期使用的方便性，故中国药典的培养基一并使用，两家进行比较，如果并无差别，后续就可直接采用中国药典的培养基。
建议初次活化的人，也同时使用两家的培养基，以确认中国药典的培养基适用性，这样后续就可以直接使用中国药典的培养基。
很不幸的是，在我们的这次比较当中，中国药典的相关培养基促支原体生长的能力比ATCC的配方培养基要差。
可以看出，ATCC的相关培养基成分要更复杂，营养成分更丰富的。并且EP、USP的支原体章节对培养基配方中脑心浸液等以液体形式加入培养基的混合性生物原材料的主要成分含量做了明确的规定。
《中国药典》支原体培养基配方中对以液体形式加入猪胃消化液和牛肉浸液，并未对两者的配方和制法作出更明确的规定。（参见不同来源药品支原体检查用培养基的促生长能力研究_赵宏大）。这就是造成国产商品化培养基质量参差不齐的不确定因素。从世界范围来讲，《中国药典》支原体培养基是属于“小众”产品。
注意：如果采用ATCC的相关培养基，其中像酪蛋白胰蛋白酶消化液、明胶胰脏消化液、马血清、10X CMRL 1066培养基、酵母提取物等配方中有些添加物是不对国内出售的，要和ATCC咨询替代产品，提早订购，免得耗时太久。
03 活化
根据ATCC的产品说明书，步骤总结如下：
a. 按照随附说明打开小瓶。
b. 使用1ml移液器，移取0.5ml规定的肉汤培养基水化冻干粉。并混匀。
c.通过从原始管中转移0.25mL至含有2.5mL的管进行连续稀释。稀释是重要的，可保持支原体培养处于不同的生长阶段。一旦达到酸性或碱性条件，许多菌株将迅速消亡。
d. 液体培养基在密闭容器内培养，使用未接种的肉汤管作为阴性对照。
e. 可以接种平板以检查菌落形态。在37℃ 5％CO2中生长。固体培养基在微需养中培养，并保持充足湿度，防止琼脂表面干燥。
f. 口腔支原体接种到液体培养基里，在48到72小时内，在前几个稀释管中会出现中等到轻度的混浊。固体培养基上出现菌落需要更长培养时间。肺炎支原体菌株生长更缓慢，并且产生非常轻的浊度。可根据颜色变化来决定何时终止培养。从红色到橙色到黄色的指标变化很容易识别。当培养基为橙色时，支原体最好转移传代。变为黄色后，支原体已经开始死亡。
肺炎支原体各个培养阶段颜色变化
口腔支原体和肺炎支原体的菌落镜检图
支原体煎蛋型菌落实物图
支原体菌落结构图
“支原体由于缺少细胞壁，所以在固体培养基上会形成特殊的“油煎蛋”状，其中“蛋黄”部分是支原体向培养基内部生长的结果，“蛋清”部分是支原体在培养基表面生长形成的。在同一视野下区分支原体、细胞残渣、气泡对检定人员对支原体形态的辨识度要求较高，细胞残渣在固体培养基上没有均一的形态，边缘不整齐。而气泡在镜下观察则中心部分由于透光率高，镜下观察中心明亮，四周较暗。只有很好的区分出三者的区别才能在检测中减少误判、错判的概率。
培养时间、培养基成分对支原体在固体培养上的形态也有一定影响。一般支原体在固体培养基中培养2 ～ 3 天后才能在镜下观察到“油煎蛋”形态，且从第2 天起支原体向四周生长的速度明显加快，镜下菌体大小变化明显，7 天后菌体向四周生长的速度减慢但仍向培养基内部生长，菌体颜色逐渐加深、变暗，边缘由平滑变得粗糙不规整，菌体开始老化。”
——易致污染的支原体在固体培养基上的形态特征 傅元欣
04 保种
保种方法有很多种，据说液氮储存是最好的方法，不过条件受限。一般，也可采用直接分装保存含支原体的培养基；在-20℃下保存，一般保存期限为1-3年；10%甘油保存法，在-80℃冷冻下，支原体可保存约4年；支原体冻干保存，在2-8℃下，可无期限保存。建议采用10%甘油保存法，有条件的采用冻干法。
10%甘油保存法：支原体生长后，将处于含对数期的支原体的培养基高速离心收集，肺炎支原体建议9000rpm离心30分钟，口腔支原体自己评估。倒去上清液，再悬浮于适量相应的新鲜肉汤培养基中。加入等量的20%甘油，甘油终浓度为10%。20%甘油可以高温灭菌，也可过滤除菌。
冻干法：支原体生长后，将处于含对数期的支原体的培养基高速离心收集，倒去上清液，再悬浮于适量相应的新鲜肉汤培养基中。加入等量的ATCC培养基9520（ATCC培养基9520为10％BSA和20％蔗糖的混合物，过滤除菌既得）中悬浮并彻底混合。取适量悬浮液分配到每个安瓿瓶中。放入冻干机内进行冻干。冻干程序可参考《ATCC细菌学指南》相关规定。
支原体冻干粉
中国药典和欧美药典差异
通过对比可以看出，中国药典在支原体培养法中和欧美药典的差异、甚至可以说是不足，这是十分值得思考和总结的。
例如：
①CP所用培养基促支原体生长能力偏弱；
②CP没有规定支原体的培养条件中需氧量；
③CP没有限定支原体的传代次数；
④CP在支原体检查第一法中，并没有要求同步做阳性对照和阴性对照；
⑤CP仅凭肉汤颜色变化，便判断有无支原体并不够严谨，颜色的变化是有多种可能原因的，有可能是微生物污染，导致培养基pH变化，导致酚红指示剂颜色的变化。在判标上，欧美都要求将肉汤再次接种到平板上通过菌落判断。
中美药典的这些差异，给企业在实际操作过程中带来了不小的困惑和不确定性。因此，建议下一版《中国药典》在修订时，将培养条件、液体培养基及固体培养基具体的培养方法以及增加观察菌落来判断等内容都能进一步明确，减少企业在实际操作过程中的困惑。
参考资料
1、ATCC23714口腔支原体和ATCC15531肺炎支原体产品说明、检验报告
2、ATCC细菌学指南《ATCC Bacteriology_Guide》
3、2015《中国药典》三部3301 支原体检查法
4、USP 《63支原体检查法》、
5、EP《2.6.7. MYCOPLASMAS》
6、《支原体学》第2版
7、《支原体-医学微生物学》
8、《支原体与支原体病》
9、浅谈国内支原体培养和鉴定中存在的问题_赵旺胜
10、支原体检查试验培养条件考察_赵宏大
11、易致污染的支原体在固体培养基上的形态特征_傅元欣-
12、中国药典与欧美药典对支原体检查培养基规定的差异
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