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氨咖黄敏胶囊微生物限度检查 方法适用性验证方案
山东拓普生物工程有限公司
Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd
氨咖黄敏胶囊微生物限度检查
方法适用性验证方案
目 录
1. 概述
2. 验证目的和范围
3. 组织及职责
4. 验证进度计划表
5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认
6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认
7.验证项目和验证方法
7.1试验菌株
7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备
7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法
7.4控制菌检查方法验证—常规倾注平皿法
8.偏差与漏项控制
9.验证报告会审
1. 概述
我公司生产品种氨咖黄敏胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。
本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
2. 验证目的和范围
验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的氨咖黄敏胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。
3.组织及职责
3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准
验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量部经理批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量部经理批准报告。
3.2验证方案实施过程中的变更和偏差
验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量部经理应当组织进行评估并采取相应的控制措施。
3.3 验证工作小组成员表
姓名
部门及职务
职 责
质量部经理
负责验证方案及报告的批准
质量部QC组长
负责验证方案审核、实施、汇总报告及培训工作
质量部QC
负责验证方案起草、具体实施、报告工作
4. 验证进度计划表
本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是 年 月至 年 月。
5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认
5.1.主要检验仪器设备确认表
序号
仪器设备名称
型 号
编号
校准单位
校准日期
有效期至
1
电热恒温培养箱1
2
电热恒温培养箱2
3
霉菌培养箱
4
高压蒸汽灭菌锅
5
单人净化工作台
检查人/日期： 复核人/日期：
5.2.验证所需文件的确认表
文件名称
是否有效版本
文件保存处
《中国药典》2015年版四部
□是 □否
质量部
检查人/日期： 复核人/日期：
6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认
6.1.试验菌种检查表
序号
菌种名称
代码
冻干菌种
批号
来源
1
金黄色葡萄球菌
CMCC（B）26003
山东拓普生物工程有限公司
2
铜绿假单胞菌
CMCC（B）10104
山东拓普生物工程有限公司
3
枯草芽孢杆菌
CMCC（B）63501
山东拓普生物工程有限公司
4
白色念珠菌
CMCC（F）98001
山东拓普生物工程有限公司
5
黑曲霉
CMCC（F）98003
山东拓普生物工程有限公司
6
大肠埃希菌
CMCC（B）44102
山东拓普生物工程有限公司
7
乙型副伤寒沙门菌
CMCC（B）50094
山东拓普生物工程有限公司
检查人/日期： 复核人/日期：
6.2试验所需的培养基检查
序号
名称
生产厂家
是否通过培养基适用性试验
批号
01
胰酪大豆胨液体培养基
山东拓普生物工程有限公司
□是 □否
02
胰酪大豆胨琼脂培养基
山东拓普生物工程有限公司
□是 □否
03
沙氏葡萄糖琼脂培养基
山东拓普生物工程有限公司
□是 □否
04
麦康凯液体培养基
山东拓普生物工程有限公司
□是 □否
05
麦康凯琼脂培养基
山东拓普生物工程有限公司
□是 □否
06
RV沙门菌增菌液体培养基
山东拓普生物工程有限公司
□是 □否
07
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
山东拓普生物工程有限公司
□是 □否
08
三糖铁琼脂培养基
山东拓普生物工程有限公司
□是 □否
检查人/日期： 复核人/日期：
6.3. 检验样品确认表
序号
品名
生产厂家
批号
规格
是否按GMP要求生产
1
氨咖黄敏胶囊
*****有限公司
复方
□是 □否
2
氨咖黄敏胶囊
*****有限公司
复方
□是 □否
3
氨咖黄敏胶囊
*****有限公司
复方
□是 □否
检查人/日期： 复核人/日期：
7.验证项目和验证方法
7.1试验菌株
氨咖黄敏胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
7.2 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备
分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。
接种白色念珠菌的新鲜培养物至100ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20～25℃培养5～7天，直到获得丰富的孢子。加入3～5ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，制成50～100cfu/m的孢子悬液备用。
菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃ ,在验证过的贮存期内使用。
验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。
7.3. 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法
7.3.1.供试液的制备
取供试品10.0g，加PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，制成1：10的供试液。
7.3.2.试验组
取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置30～35℃培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。
另取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。
7.3.3.供试品对照组
取1：10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。置30～35℃培养箱中培养5天，点计菌落数。
另取1：10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。
7.3.4.菌液对照组
取PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置30～35℃培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。
另取PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。
7.3.5. 常规倾注平皿法方法验证的接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即试验菌的回收率)应在0 .5〜2 范围内。
7.3.6. 常规倾注平皿法方法验证的结果
7.3.6.1. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果
试验次数1：
氨咖黄敏胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：
培养箱型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期： 复核人/日期：
试验次数2：
氨咖黄敏胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：
培养箱型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期： 复核人/日期：
试验次数3：
氨咖黄敏胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：
培养箱型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期： 复核人/日期：
7.3.6.2. 常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果
试验次数1：
氨咖黄敏胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：
培养箱型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期： 复核人/日期：
试验次数2：
氨咖黄敏胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：
培养箱型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期： 复核人/日期：
试验次数3：
氨咖黄敏胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：
培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期： 复核人/日期：
7.3.7. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结
7.4.控制菌检查方法验证—常规倾注平皿法
7.4.1试验菌株
氨咖黄敏胶囊质量标准中规定检查的控制菌为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌，所以选择这两种菌株进行控制菌检查的方法学验证。试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
7.4.2 控制菌检查方法验证的菌液制备
分别接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。
菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。
7.4.3大肠埃希菌检查方法验证
7.4.3.1供试液的制备
取供试品10.0g，加PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，制成1：10的供试液。
7.4.3.2.试验组
取供试液10ml，加入7.4.2项下制备的50～100cfu的大肠埃希菌接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。
取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,42～44℃培养24～48小时。
取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。
7.4.3.3阳性对照组
照7.4.2项下菌液制备方法，以0.9%无菌氯化钠为稀释液，将大肠埃希菌液稀释至含菌50～100cfu/ml，取 菌液1 ml，接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。
取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,42～44℃培养24～48小时。
取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。
7.4.3.4阴性对照组
取PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液10ml，接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。阴性对照应无菌生长。
7.4.3.5常规倾注平皿法测定大肠埃希菌方法验证结果
试验次数1：氨咖黄敏胶囊批号:
大肠埃希菌对照菌来源 批号（菌种编号）
过程
增菌培养
选择培养
分离培养
结果判断
培养基
胰酪大豆胨液体培养基
配制批号
麦康凯液体培养基
配制批号
麦康凯琼脂培养基
平板 配制批号
培养箱
型号 编号
温度 ℃
型号 编号
温度 ℃
型号 编号
温度 ℃
培养时间
开始 月 日 时
结束 月 日 时
开始 月 日 时
结束 月 日 时
开始 月 日 时
结束 月 日 时
试验组
阳性
对照组
阴性
对照组
试验人/日期： 复核人/日期：
试验次数2：氨咖黄敏胶囊批号:
大肠埃希菌对照菌来源 批号（菌种编号）
过程
增菌培养
选择培养
分离培养
结果判断
培养基
胰酪大豆胨液体培养基
配制批号
麦康凯液体培养基
配制批号
麦康凯琼脂培养基
平板 配制批号
培养箱
型号 编号
温度 ℃
型号 编号
温度 ℃
型号 编号
温度 ℃
培养时间
开始 月 日 时
结束 月 日 时
开始 月 日 时
结束 月 日 时
开始 月 日 时
结束 月 日 时
试验组
阳性
对照组
阴性
对照组
试验人/日期： 复核人/日期：
试验次数3：氨咖黄敏胶囊批号:
大肠埃希菌对照菌来源 批号（菌种编号）
过程
增菌培养
选择培养
分离培养
结果判断
培养基
胰酪大豆胨液体培养基
配制批号
麦康凯液体培养基
配制批号
麦康凯琼脂培养基
平板 配制批号
培养箱
型号 编号
温度 ℃
型号 编号
温度 ℃
型号 编号
温度 ℃
培养时间
开始 月 日 时
结束 月 日 时
开始 月 日 时
结束 月 日 时
开始 月 日 时
结束 月 日 时
试验组
阳性
对照组
阴性
对照组
试验人/日期： 复核人/日期：
7.4.3.6大肠埃希菌检查方法验证结果小结
7.4.4沙门菌检查方法验证
7.4.4.1.试验组
取10g供试品接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中，加入7.4.2项下制备的50～100cfu的乙型副伤寒沙门菌2ml， 30～35℃培养18～24小时。
取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基,30～35℃培养18～24小时。
取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～48小时。
沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。
用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时。
7.4.4.3阳性对照组
取7.4.2项下制备的50～100cfu的乙型副伤寒沙门菌2ml接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中，， 30～35℃培养18～24小时。
取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基,30～35℃培养18～24小时。
取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～48小时。
沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。
用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时。
7.4.4.4阴性对照组
取0.9%无菌氯化钠溶液2 ml，接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。阴性对照应无菌生长。
7.4.4.5常规倾注平皿法测定乙型副伤寒沙门菌方法验证结果
试验次数1：氨咖黄敏胶囊批号:
乙型副伤寒沙门菌对照菌来源 批号（菌种编号）
过程
增菌培养
选择培养
分离培养
结果判断
培养基
胰酪大豆胨液体培养基
配制批号
RV沙门增菌液体培养基
配制批号
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 平板
配制批号
三糖铁琼脂培养基斜面和高层穿刺接种
配制批号
培养箱
型号
编号
温度 ℃
型号
编号
温度 ℃
型号
编号
温度 ℃
型号
编号
温度 ℃
培养
时间
月 日 时
至 月 日 时
月 日 时
至 月 日 时
月 日 时
至 月 日 时
月 日 时
至 月 日 时
试验组
阳性
对照组
阴性
对照组
试验人/日期： 复核人/日期：
试验次数2：氨咖黄敏胶囊批号:
乙型副伤寒沙门菌对照菌来源 批号（菌种编号）
过程
增菌培养
选择培养
分离培养
结果判断
培养基
胰酪大豆胨液体培养基
配制批号
RV沙门增菌液体培养基
配制批号
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 平板
配制批号
三糖铁琼脂培养基斜面和高层穿刺接种
配制批号
培养箱
型号
编号
温度 ℃
型号
编号
温度 ℃
型号
编号
温度 ℃
型号
编号
温度 ℃
培养
时间
月 日 时
至 月 日 时
月 日 时
至 月 日 时
月 日 时
至 月 日 时
月 日 时
至 月 日 时
试验组
阳性
对照组
阴性
对照组
试验人/日期： 复核人/日期：
试验次数3：氨咖黄敏胶囊批号:
乙型副伤寒沙门菌对照菌来源 批号（菌种编号）
过程
增菌培养
选择培养
分离培养
结果判断
培养基
胰酪大豆胨液体培养基
配制批号
RV沙门增菌液体培养基
配制批号
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 平板
配制批号
三糖铁琼脂培养基斜面和高层穿刺接种
配制批号
培养箱
型号
编号
温度 ℃
型号
编号
温度 ℃
型号
编号
温度 ℃
型号
编号
温度 ℃
培养
时间
月 日 时
至 月 日 时
月 日 时
至 月 日 时
月 日 时
至 月 日 时
月 日 时
至 月 日 时
试验组
阳性
对照组
阴性
对照组
试验人/日期： 复核人/日期：
7.4.4.6乙型副伤寒沙门菌检查方法验证结果小结
8.偏差与漏项控制：
微生物限度检查方法验证过程中存在和发现的任何偏差与漏项，都应进行详细的记录，并应按公司GMP文件《偏差处理规程》进行调查与处理。
偏差调查与处理的报告和支持文件，应作为此确认方案的附录部分。
偏差和漏项记录表
偏差和漏项：
处理过程：
检查人/日期： 复核人/日期：
验证报告会审表
验证项目名称
氨咖黄敏胶囊微生物
限度检查方法验证
验证起止日期
验证结论：
评价和建议：
验证报告会审人签名
起草
部门：质量部QC组
签名/日期：
审核
部门：质量部QC组
签名/日期：
批准
质量部经理
签名/日期：
9.验证报告会审
