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注射用水微生物限度检查方法验证
山东拓普生物工程有限公司
Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd
注射用水微生物限度检查方法
验证方案
文件编码：
项 目
姓 名
签 名
日 期
起 草
审 核
审 核
批 准
生效日期
年 份
注射用水微生物限度检查方法验证目录
1、注射用水微生物限度检查方法验证计划
2、注射用水微生物限度检查方法验证小组名单
3、注射用水微生物限度检查方法验证方案
4、注射用水微生物限度检查方法验证培训记录
5、注射用水微生物限度检查方法验证附属记录
6、注射用水微生物限度检查方法验证报告
7、注射用水微生物限度检查方法验证合格证书
注射用水微生物限度检查方法验证计划
根据我公司认证领导小组的要求及验证委员会的安排，对注射用水微生物限度检查方法进行验证，具体安排如下：
一、年月日—年月日，制定验证方案，由注射用水微生物限度检查方法验证小组组长负责起草。
二、年月日—年月日，验证方案讨论、修改、审批和培训。
三、年月日—年月日，验证工作实施。
四、年月日—年月日，根据验证情况与记录，书写验证报告。
注射用水微生物限度检查方法验证小组名单
组 长：
成 员：
一、 目的
《中华人民共和国药典》2010版二部规定注射用水微生物限度检查采用薄膜过滤法，确认该方法适合于本公司注射用水中细菌、霉菌及酵母菌数测定。
二、 适用范围
本公司注射用水中细菌、霉菌及酵母菌的测定。
三、 内容
1. 概述
当建立微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌的计数方法验证 ，已确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
2. 验证项目及认可标准
对各试验菌的回收率逐一进行验证，试验组的菌回收率不得低于70%（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）。
3. 验证依据
《中华人民共和国药典》2010版二部附录XI J微生物限度检查法。
4. 验证方法与内容
4.1. 验证方法 采用薄膜过滤法进行细菌、霉菌及酵母菌的测定。
4.2. 验证试验分3组，至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。
4.3. 仪器设备
4.3.1. TMQ.R-3870型台式灭菌器
4.3.2. HPX-9272MBE型电热恒温培养箱 (30～35℃)
4.3.3. 单人净化工作台
4.3.4. MJ-160霉菌培养箱 (23～28℃)
4.4. 培养基
4.4.1. 营养肉汤培养基
4.4.2. 营养琼脂培养基
4.4.3. 玫瑰红钠琼脂培养基
4.4.4. 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基
4.4.5. 改良马丁培养基
4.5. 验证过程与方法
4.5.1. 取样：由质量部生测室检验人员负责取样。用灭菌好的锥形瓶取注射用水（注A-0、注A-7、注B-8、注B-0）取样点水样各1500ml,立即送质量部生测室检验。
4.5.2. 菌液制备
a. 取经35～36℃培养18~24小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、与枯草芽孢杆菌营养肉汤新鲜培养物1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-6~10-7约50~100cfu∕ml的菌悬液备用。
b. 取经24～25℃培养24~48小时的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5约为50~100cfu∕ml的菌悬液备用。
c. 取经24～25℃培养一周的黑曲霉菌斜面培养物，加3~5ml含0.05%（ml∕ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液，用垫有脱脂棉的漏斗（湿热灭菌）过滤，除去菌丝，收集孢子悬液至另一无菌试管内作为菌原液，取此孢子悬液1ml加到9ml含0.05%（ml∕ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5约为50~100cfu∕ml的菌悬液备用。
4.5.3. 菌液计数（每种菌液至少接种2个平皿）
a. 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌各1ml分别接种至营养琼脂培养基，置30～35℃培养48小时计数；
b. 取白色念珠菌、黑曲霉各1ml分别接种至玖瑰红钠琼脂培养基，置23～28℃培养72小时计数；
c. 取白色念珠菌1ml接种至酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基置23～28℃培养72小时计数。
d. 计数结果见验证记录
4.5.4. 验证方法
a. 试验组 取注射用水100ml 和50～100cfu试验菌，过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上培养。每株试验菌平行制备2个平皿，按薄膜过滤法测定其菌数，每片滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
b. 菌液组 取50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿菌落计数法测定其菌数。
c. 供试品对照组 取注射用水100ml，过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上培养。同法，细菌、霉菌及酵母菌各制备2个平皿，测定供试品本底菌数。
d. 验证结果见验证记录。
5. 组织实施
5.1. 验证机构的组成
5.1.1. 公司验证委员会，负责所有验证工作的领导和组织、审批验证方案和验证报告、发放验证证书。
5.1.2. 注射用水微生物限度检查方法验证工作小组，负责该验证项目的验证方案起草、实施、组织与协调实施，负责验证样品检测，完成各项记录，根据检验和确认结果进行评定、完成验证报告。
部门
部门职责
责任人
工作划分
质量部
方案起草、实施、书写报告
操作实施
质量部
取样、检验、出报告
操作实施
验证
委员会
方案审定、批准、实施、发放验证合格证
方案审核
方案批准
5.2. 实施时间为：年月日—年月日。
四、 附件及相关表格文件
注射用水微生物限度检查方法
验证报告
文件编码：
项 目
姓 名
签 名
日 期
起 草
审 核
审 核
批 准
生效日期
年 份
一、 验证概述
为保证药品质量，根据本公司验证工作领导小组的要求及验证委员会的安排，对C/D生产线注射用水系统进行微生物限度检查方法验证。
1. 验证组织与实施
1.1. 验证小组成员及职责分工
部门
部门职责
责任人
工作划分
质量部
方案起草、实施、书写报告
操作实施
质量部
取样、检验、出报告
操作实施
验证
委员会
方案审定、批准、实施、发放验证合格证
方案审核
方案批准
1.2. 本验证由质量部负责并由相关人员根据《注射用水微生物限度检查方法验证方案》所规定的方法与步骤实施。
二、 各项目验证结论
1. 验证用培养基
名称
生产厂家
批号
配制批号
营养琼脂培养基
营养肉汤培养基
玫瑰红钠琼脂培养基
改良马丁培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基
2. 验证用菌株：来源于贵州省药品检验所
验证菌株
菌株代数
增菌培养基
培养温度
培养时间（小时）
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉菌
3. 各取样点菌落计数回收率 验证结果见下表
独立试验一 ：各试验组菌落计数（回收率%） 取样点
试验日期 年 月 日 报告日期 年 月 日
验证菌株
平皿号
试验组
CFU∕100ml
菌液组
CFU/ml
供试品对照组
CFU∕100ml
试验组菌
回收率（%）
大肠埃希菌
(营养琼脂)
1
2
平均值
金黄色葡萄球菌
(营养琼脂)
1
2
平均值
枯草芽孢杆菌
(营养琼脂)
1
2
平均值
白色念珠菌
(玖瑰红钠琼脂
培养基)
1
2
平均值
黑曲霉
(玖瑰红钠琼脂
培养基)
1
2
平均值
白色念珠菌
（酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基）
1
2
平均值
试验人 复核人
独立试验二：各试验组菌落计数（回收率%） 取样点
试验日期 年 月 日 报告日期 年 月 日
验证菌株
平皿号
试验组
CFU∕100ml
菌液组
CFU/ml
供试品对照组
CFU∕100ml
试验组菌
回收率（%）
大肠埃希菌
(营养琼脂)
1
2
平均值
金黄色葡萄球菌
(营养琼脂)
1
2
平均值
枯草芽孢杆菌
(营养琼脂)
1
2
平均值
白色念珠菌
(玖瑰红钠琼脂
培养基)
1
2
平均值
黑曲霉
(玖瑰红钠琼脂
培养基)
1
2
平均值
白色念珠菌
（酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基）
1
2
平均值
结论：
试验人 复核人
独立试验三 ：各试验组菌落计数（回收率%） 取样点
试验日期 年 月 日 报告日期 年 月 日
验证菌株
平皿号
试验组
CFU∕100ml
菌液组
CFU/ml
供试品对照组
CFU∕100ml
试验组菌
回收率（%）
大肠埃希菌
(营养琼脂)
1
2
平均值
金黄色葡萄球菌
(营养琼脂)
1
2
平均值
枯草芽孢杆菌
(营养琼脂)
1
2
平均值
白色念珠菌
(玖瑰红钠琼脂
培养基)
1
2
平均值
黑曲霉
(玖瑰红钠琼脂
培养基)
1
2
平均值
白色念珠菌
（酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基）
1
2
平均值
结论：
试验人 复核人
独立试验四 ：各试验组菌落计数（回收率%） 取样点
试验日期 年 月 日 报告日期 年 月 日
验证菌株
平皿号
试验组
CFU∕100ml
菌液组
CFU/ml
供试品对照组
CFU∕100ml
试验组菌
回收率（%）
大肠埃希菌
(营养琼脂)
1
2
平均值
金黄色葡萄球菌
(营养琼脂)
1
2
平均值
枯草芽孢杆菌
(营养琼脂)
1
2
平均值
白色念珠菌
(玖瑰红钠琼脂
培养基)
1
2
平均值
黑曲霉
(玖瑰红钠琼脂
培养基)
1
2
平均值
白色念珠菌
（酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基）
1
2
平均值
结论：
试验人 复核人
三、 建议、结果分析和验证总结
1. 建议
1.1. 加强生测室检验人员的操作技能培训，使检验过程标准化，程序化。
1.2. 当注射用水系统在日常微生物限度检测时出现异常的检测结果时，应进行实验室偏差处理或应再次进行注射用水微生物限度检查方法的再验证。
2. 结果分析及验证总结
2.1. 试验菌计数结果判定 各试验菌稀释后含菌量均达到50～100cfu/ml，符合试验要求。
2.2. 根据验证结果， 4个取样点水样本次试验各试验组的菌回收率均不低于70%，按标准规定，本次试验结果符合规定。
2.3. 根据上述验证过程及结果分析，本公司生测实验室采用薄膜过滤法对注射用水的微生物限度检查符合《中华人民共和国药典》2010年版二部的要求，日常检测可以采用此检验方法进行注射用水的微生物限度检查。
五、年月日—年月日，验证报告审核批准，合格证发放。
结论：
