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菌液稀释级数确认方案
山东拓普生物工程有限公司
Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd
1 目的
建立菌液稀释级数确认方案，确定含菌量为50～100cfu/ml或10～100cfu/ml时，各试验菌应当稀释的倍数或级数。
2 适用范围
2.1 本确认方案适用于验证试验或日常工作中涉及的菌种稀释操作。
2.2 确认对象为：
50～100cfu/ml：大肠埃希菌MCC(B)44102、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、白色念珠菌霉CMCC(F)98001。
10～100cfu/ml：乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094。
3 依据
《药品GMP》现行版、
《药品GMP指南》国家药监局认证中心编写 2011年版
《中国药典》现行版。
《中国药品检验标准操作规程》现行版。
4 验证时间
验证方案于 年 月 日批准后，整个验证活动应在10个工作日内完成。
5 验证小组成员及职责
小组职务
岗位
姓名
责任
组长
化验室主任主任
编制验证方案，编制验证报告；进行验证过程及结论的评价与分析；组织协调实施本验证工作。
组员
QA主管
对编制的方案进行审核
质量部部长
批准再验证方案；评价与分析确认结果；对验证报告进行最终结论。
QA
监督和复核方案实施过程。
微检QC
负责方案的执行。
6 验证所需要的仪器设备、培养基、菌种及关键操作文件
6.1 验证需用仪器设备
器具名称
规格型号
检定日期
检定单位
有效期
细菌培养箱
霉菌培养箱
高压蒸汽灭菌器
架盘天平
水浴锅
净化工作台（阳性）
6.2 试验培养基
名称
生产厂家
批号
有效期
胰酪大豆胨琼脂培养基
拓普生物
胰酪大豆胨液体培养基
拓普生物
沙氏葡萄糖琼脂培养基
拓普生物
沙氏葡萄糖液体培养基
拓普生物
pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液
拓普生物
6.3 试验菌种
菌珠名称
来源
购入日期
传代次数
大肠埃希菌
MCC(B)44102
金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003
枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501
白色念珠菌霉CMCC(F)98001
乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094
6.4 验证所需要关键文件及存放地方
关键资料名称
存放地点
《细菌培养箱使用和清洁操作规程》
《霉菌培养箱使用和清洁操作规程》
《高压蒸汽灭菌器使用和清洁操作规程》
《舒筋活血丸质量标准及检验方法》
《微生物限度检查法操作规程》
7 接受标准
7.1 阴性对照组测试结果应为阴性。
7.2 各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。
7.3 各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀释级的菌落数应呈约10倍关系。
8 测试方法
按药典方法制备菌液，取1ml菌液在若干支含9ml的pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液中，逐级稀释成100、10-1、10-2、……10-8级数的菌悬液。分别取各级1ml，注入平皿，倾倒在琼脂培养，按平皿计数法培养，测定各级菌落数。该试验独立平行进行3次。
8.1 菌液制备
8.1.1 取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物分别接种至3支10ml胰酪大豆胨液体培养基中，经32.5℃±2.5℃培养18～24h，备用。
8.1.2 取色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，经25.5℃±2.5℃培养24～48h，备用。
8.2 无菌pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液或氯化钠溶液的制备
至少准备9ml/支×9支pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%的无菌氯化钠溶液。
8.3 稀释
8.3.1 分别取1ml菌液（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌、白色念珠菌）在1支含9mlpH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%的无菌氯化钠溶液中，用吸管吹打约10下，即成10-1级，吸取该管菌液1ml至下支含9mlpH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%的无菌氯化钠溶液中，用刻度管吹打约10下，即成10-2级，依次，逐级稀释直至10-8级数，每递增一个稀释级，必须换一个吸管。
8.4 注皿
分别吸取上述各菌各级菌悬液1ml于平皿中，平行制备2个皿，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌倾倒约15ml的胰酪大豆胨琼脂培养基，白色念珠菌倾倒沙氏葡萄糖琼脂培养基。按《微生物限度检查法操作规程》中的平皿法，培养，测定各皿各菌菌落数。
9 测试结果：见附表1、2、3。
10 异常情况及处理：
质量负责人： 验证小组组长： QA：
11 结论
11.1 按照本确认方案，确定了各菌达到规定含菌量时的稀释级别。
菌珠名称
含菌量
确定的稀释级别
大肠埃希菌
MCC(B)44102
50～100cfu/ml
金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003
枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501
白色念珠菌霉CMCC(F)98001
乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094
10～100cfu/ml
质量负责人： 验证小组组长： QA：
12 再验证周期
12.1 当操作人员或接种方法发生变化时，需要对本方案进行调整后作方法学再验证。
12.2 国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行再验证。
12.3 定期验证暂定为二年。
菌液稀释级别确认记录（单位：cfu）
第 1 次试验
试验日期： 报告日期：
培养皿性质
胰酪大豆胨琼脂培养基
沙氏葡萄糖琼脂培养基
金黄色葡萄球菌
大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌
乙型副伤寒沙门菌
白色念珠菌
培养温度℃
培养时间
级数
皿号
1
2
平均
1
2
平均
1
2
平均
1
2
平均
1
2
平均
10-0
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
接受标准
50～100cfu/ml
10～100cfu/ml
50～100cfu/ml
符合要求的级数
分析：1、阴性对照组，即10-0级，测试结果应为阴性。
结果：□符合要求 □不符合要求
2、各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。
结果：□符合要求 □不符合要求
3、各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀释级的菌落数应呈约10倍关系。
结果：□符合要求 □不符合要求
检验人： 复核人： 质量部QA:
附表2
菌液稀释级别确认记录（单位：cfu）
第 2 次试验
试验日期： 报告日期：
培养皿性质
胰酪大豆胨琼脂培养基
沙氏葡萄糖琼脂培养基
金黄色葡萄球菌
大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌
乙型副伤寒沙门菌
白色念珠菌
培养温度℃
培养时间
级数
皿号
1
2
平均
1
2
平均
1
2
平均
1
2
平均
1
2
平均
10-0
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
接受标准
50～100cfu/ml
10～100cfu/ml
50～100cfu/ml
符合要求的级数
分析：1、阴性对照组，即10-0级，测试结果应为阴性。
结果：□符合要求 □不符合要求
2、各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。
结果：□符合要求 □不符合要求
3、各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀释级的菌落数应呈约10倍关系。
结果：□符合要求 □不符合要求
检验人： 复核人： 质量部QA:
附表3
菌液稀释级别确认记录（单位：cfu）
第 3 次试验
试验日期： 报告日期：
培养皿性质
胰酪大豆胨琼脂培养基
沙氏葡萄糖琼脂培养基
金黄色葡萄球菌
大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌
乙型副伤寒沙门菌
白色念珠菌
培养温度℃
培养时间
级数
皿号
1
2
平均
1
2
平均
1
2
平均
1
2
平均
1
2
平均
10-0
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
接受标准
50～100cfu/ml
10～100cfu/ml
50～100cfu/ml
符合要求的级数
分析：1、阴性对照组，即10-0级，测试结果应为阴性。
结果：□符合要求 □不符合要求
2、各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。
结果：□符合要求 □不符合要求
3、各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀释级的菌落数应呈约10倍关系。
结果：□符合要求 □不符合要求
检验人： 复核人： 质量部QA:
附表1
