一种高效的片段靶向敲入和替换技术

近年来，CRISPR/Cas介导的植物基因组定点编辑技术在农作物基因功能研究和精准育种中发挥了重要作用，展现了广阔的发展潜力和应用前景。然而，CRISPR/Cas介导的植物基因组定点敲除技术只能在基因组特定位点产生随机插入和删除，精准的片段插入和替换的效率一直很低，极大地限制了其在植物研究和育种上的应用。因此，迫切需要建立更高效的植物基因组片段插入和替换技术体系。

由中国科院上海植物逆境生物学研究中心/中国科学院上海分子植物科学卓越创新中心朱健康院士领衔的研究团队在植物基因组编辑领域再次取得重要进展。研究人员采用修饰后的DNA片段作为供体，在水稻上建立了一种高效的片段靶向敲入和替换技术，高至50%的靶向敲入效率将极大地方便植物的研究和育种。

植物基因组编辑是朱健康实验室的重点研究领域，他们在近几年来获得了一系列的进展。作为该领域的重大难题，片段的靶向敲入和替换一直是他们的一个重要研究目标，也一直在围绕这一目标努力。在成功地建立了病毒介导的同源重组（HDR）和各类单碱基编辑技术等多种方法的同时，他们也开始尝试在供体DNA片段上寻找突破点，以克服现有方法效率低、应用范围窄等缺陷。核酸修饰在人的RNAi疗法和核酸疫苗等医学领域有广泛的应用。

朱健康课题组通过尝试，发现将供体片段同时进行硫代修饰和磷酸化修饰后，能极大地增强CRISPR/Cas9引导的靶向敲入效率。他们先后在14个基因位点上成功靶向敲入了各类调控元件，包括翻译增强子、转录调控元件，甚至整个启动子，供体片段最长达2049bp。通过对1393株各类T0代基因编辑水稻植株的分析发现，该方法的敲入效率可高达47.3%，平均效率为25%。高效的敲入效率甚至可以同时在四个位点上实现多基因靶向敲入。可以预计，该技术的建立将使靶向敲入成为一项和靶向敲除一样的常规实验，被各个植物研究和育种单位广泛应用。
在此基础上，朱健康研究团队又巧妙地设计了一种片段精准替换的策略，称之为重复片段介导的同源重组（TR-HDR）方法。常规的HDR频率极其低下，但他们在前期的实验中发现，基因组上串联重复片段间的HDR频率非常高。

他们利用现象，通过将修饰的片段靶向敲入至目标位点后，人为制造这种串联重复结构，诱导TR-HDR去实现片段替换。采用该技术，他们在五个基因位点上实现了片段替换和原位的Flag标签蛋白的精准融合，效率最高达到了11.4%。这一技术突破将非常有助于植物学研究，并大大促进农作物定向遗传改良的进程。