GB/T 4789.5-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验

[所属分类:GB/T 4789] [发布时间:2019-8-9] [发布人:wwxa] [阅读次数:] [返回]

中华人民共和国国家标准
GB 4789.5—2012
食品安全国家标准
食品微生物学检验 志贺氏菌检验
中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部
发布
2012-05-17 发布  2012-07-17 实施
GB 4789.5-2012
I
前 言
本标准代替GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》。
本标准与GB/T 4789.5-2003 相比，主要变化如下：
——修改了标准名称；
——修改了培养基和试剂；
——修改了操作步骤中增菌部分和生化试验及附加生化试验部分；
——修改了表2；
——修改了表4。
GB 4789.5-2012
2
食品安全国家标准
食品微生物学检验 志贺氏菌检验
1 范围
本标准规定了食品中志贺氏菌(Shigella)的检验方法。
本标准适用于食品中志贺氏菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a） 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃；
b） 冰箱：2 ℃～5 ℃；
c） 膜过滤系统；
d） 厌氧培养装置：41.5 ℃1 ℃；
e） 电子天平：感量 0.1 g；
f） 显微镜：10×～100×；
g） 均质器；
h） 振荡器；
i） 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头；
j） 无菌均质杯或无菌均质袋：容量 500 mL；
k） 无菌培养皿：直径 90 mm；
l） pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸；
m） 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂
3.1 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见附录 A 中 A.1。
3.2 麦康凯（MAC）琼脂：见附录 A 中 A.2。
3.3 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂：见附录 A 中 A.3。
3.4 志贺氏菌显色培养基。
3.5 三糖铁（TSI）琼脂：见附录 A 中 A.4。
3.6 营养琼脂斜面：见附录 A 中 A.5。
3.7 半固体琼脂：见附录 A 中 A.6。
3.8 葡萄糖铵培养基：见附录 A 中 A.7。
3.9 尿素琼脂：见附录 A 中 A.8。
GB 4789.5-2012
3
3.10 β-半乳糖苷酶培养基：见附录 A 中 A.9。
3.11 氨基酸脱羧酶试验培养基：见附录 A 中 A.10。
3.12 糖发酵管：见附录 A 中 A.11。
3.13 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录 A 中 A.12。
3.14 粘液酸盐培养基：见附录 A 中 A. 13。
3.15 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录 A 中 A.14。
3.16 志贺氏菌属诊断血清。
3.17 生化鉴定试剂盒。
4 检验程序
志贺氏菌检验程序见图 1。
GB 4789.5-2012
4
图 1 志贺氏菌检验程序
5 操作步骤
5.1 增菌
以无菌操作取检样 25 g（mL），加入装有灭菌 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均
质器以 8 000 r/min～10 000 r/min 均质；或加入装有 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质
器连续均质 1 min～2 min，液体样品振荡混匀即可。于 41.5 ℃±１℃，厌氧培养 16 h～20 h。
5.2 分离
取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板
上，于 36 ℃1 ℃培养 20 h～24 h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大
于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至 48 h 再进行观察。志贺氏菌在
不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表 1。
36  ℃±１℃ ，20 h～48 h
XLD
挑取可疑菌落
TSI，半固体，
营养琼脂斜面
MAC 或志贺氏菌显色培养基
生化鉴定
报告
血清学分型
志贺氏菌属分群及分型结果
检样
25 g（或 25 mL）样品+志贺氏菌增菌肉汤 225 mL
41.5 ℃±１℃，
16 h～20 h 厌氧培养
GB 4789.5-2012
5
表 1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板  志贺氏菌的菌落特征
MAC 琼脂  无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐
XLD 琼脂  粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐
志贺氏菌显色培养基  按照显色培养基的说明进行判定
5.3 初步生化试验
5.3.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一
管，置36 ℃1 ℃培养20 h～24 h，分别观察结果。
5.3.2 凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏
菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其5.3.1中已培养的营养琼脂斜面
上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。
5.4 生化试验及附加生化试验
5.4.1 生化试验
用 5.3.1 中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即 β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱
羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌 13 型的鸟氨酸
阳性;宋内氏菌和痢疾志贺氏菌 1 型，鲍氏志贺氏菌 13 型的 β-半乳糖苷酶为阳性以外，其余生化试验志贺
氏菌属的培养物均为阴性结果。另外由于福氏志贺氏菌 6 型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相
似，必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧
化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得
判定为志贺氏菌属。志贺氏菌属生化特性见表 2。
表 2 志贺氏菌属四个群的生化特征
生化反应  A 群：痢疾志贺氏菌  B 群：福氏志贺氏菌  C 群：鲍氏志贺氏菌  D 群：宋内氏志贺氏菌
ß-半乳糖苷酶  － a －  － a ＋
尿素  －  －  －  －
赖氨酸脱羧酶  －  －  －  －
鸟氨酸脱羧酶  －  －  － b ＋
水杨苷  －  －  －  －
七叶苷  －  －  －  －
靛基质  －/＋  (＋)  －/＋  －
甘露醇  －  ＋ c ＋  ＋
棉子糖  －  ＋  －  ＋
甘油  (＋)  －  (＋)  d
注：+表示阳性；-表示阴性；-/+表示多数阴性；+/-表示多数阳性；（+）表示迟缓阳性；d 表示有不同生化型。
a 痢疾志贺 1 型和鲍氏 13 型为阳性。
b 鲍氏 13 型为鸟氨酸阳性。
c 福氏 4 型和 6 型常见甘露醇阴性变种。
5.4.2 附加生化实验
由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes 碱性-异型）
菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺
氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36 ℃培养 24 h～48 h)。志
贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D 菌的生化特性区别见表 3。
GB 4789.5-2012
6
表 3 志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D 菌的生化特性区别
生化反应
A 群：痢疾
志贺氏菌
B 群：福氏
志贺氏菌
C 群：鲍氏
志贺氏菌
D 群：宋内氏
志贺氏菌
大肠埃希氏菌  A-D 菌
葡萄糖铵  － － － － ＋ ＋
西蒙氏柠檬酸盐  － － － － d d
粘液酸盐  － － － d ＋ d
注 1：+表示阳性；-表示阴性；d 表示有不同生化型。
注 2：在葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性，而不活泼的大肠埃希氏菌、A-D（碱
性-异型）菌至少有一项反应为阳性。
5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据5.3.2的初步判断结果，用5.3.1中已培
养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
5.5 血清学鉴定
5.5.1抗原的准备
志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体（O）抗原。菌体 O 抗原又可分为
型和群的特异性抗原。
一般采用 1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
注 1：一些志贺氏菌如果因为 K 抗原的存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水做成浓菌液，100 ℃煮
沸 15 min～60 min 去除 K 抗原后再检查。
注 2：D 群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应。与肠杆菌科不
同，宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝。宋内氏志贺氏菌没有 K 抗原。
5.5.2 凝集反应
在玻片上划出 2 个约 1cm×2cm 的区域，挑取一环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其
中一个区域下部加 1 滴抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分
别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对着黑色背景进行观察，如果抗血清
中出现凝结成块的颗粒，而且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。如果生理盐水中出现
凝集，视作为自凝。这时，应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验。
如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性的话，则按 5.5.1 注 1 进行
试验。
5.5.3 血清学分型（选做项目）
先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果呈现凝集，则再用相应各群多价血清分别试验。先用 B 群福氏
志贺氏菌多价血清进行实验，如呈现凝集，再用其群和型因子血清分别检查。如果 B 群多价血清不凝集，
则用 D 群宋内氏志贺氏菌血清进行实验，如呈现凝集，则用其Ⅰ相和Ⅱ相血清检查；如果 B、D 群多价血
清都不凝集，则用 A 群痢疾志贺氏菌多价血清及 1～12 各型因子血清检查，如果上述三种多价血清都不凝
集，可用 C 群鲍氏志贺氏菌多价检查，并进一步用 1～18 各型因子血清检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的
型抗原和群抗原鉴别见表 4。
表 4 福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原的鉴别表
型和亚型  型抗原  群抗原
在群因子血清中的凝集
3,4  6  7,8
1a  Ⅰ  4  +  -  -
1b  Ⅰ  （4），6  (+)  +  -
2a  Ⅱ  3,4  +  -  -
2b  Ⅱ  7,8  -  -  +
GB 4789.5-2012
7
表 4（续） 福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原的鉴别表
型和亚型  型抗原  群抗原
在群因子血清中的凝集
3,4  6  7,8
3a  Ⅲ  （3，4）,6,7,8  (+)  +  +
3b  Ⅲ  （3,4）,6  (+)  +  -
4a  Ⅳ  3,4  +  -  -
4b  Ⅳ  6  -  +  -
4c  Ⅳ  7,8  -  -  +
5a  Ⅴ  （3,4）  (+)  -  -
5b  Ⅴ  7,8  -  -  +
6  Ⅵ  4  +  -  -
X  -  7,8  -  -  +
Y  -  3,4  +  -  -
注：+表示凝集；-表示不凝集；（）表示有或无。
5.6 结果报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告 25 g（mL）样品中检出或未检出志贺氏菌。
GB 4789.5-2012
8
附录A
培养基和试剂
A.1 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素（ Shigella  broth）
A.1.1 志贺氏菌增菌肉汤
A.1.1.1 成分
胰蛋白胨  20.0 g
葡萄糖 1.0 g
磷酸氢二钾  2.0 g
磷酸二氢钾  2.0 g
氯化钠  5.0 g
吐温 80（Tween 80）  1.5 mL
蒸馏水  1 000.0 mL
A.1.1.2 制法
将以上成分混合加热溶解，冷却至25 ℃左右校正pH至7.00.2，分装适当的容器，121 ℃灭菌15 min。
取出后冷却至 50 ℃~55 ℃，加入除菌过滤的新生霉素溶液（0.5 μg/mL），分装 225 mL 备用。
注：如不立即使用，在 2 ℃~8 ℃条件下可储存一个月。
A.1.2 新生霉素溶液
A.1.2.1 成分
新生霉素 25.0 mg
蒸馏水  1 000.0 mL
A.1.2.2 制法
将新生霉素溶解于蒸馏水中，用 0.22 μm 过滤膜除菌，如不立即使用，在 2 ℃~8 ℃条件下可储存一
个月。
A.1.3 临用时每 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤（A.1.1）加入 5 mL 新生霉素溶液（A.1.2），混匀。
A.2 麦康凯（MAC）琼脂
A.2.1 成分
蛋白胨  20.0 g
乳糖  10.0 g
3 号胆盐 1.5 g
氯化钠  5.0 g
中性红  0.03 g
结晶紫  0.001 g
琼脂  15.0 g
蒸馏水  1 000.0 mL
A.2.2 制法
将以上成分混合加热溶解，冷却至 25 ℃左右校正 pH 至 7.2±0.2，分装，121 ℃高压灭菌 15 min。冷
却至 45 ℃～50 ℃，倾注平板。
注：如不立即使用，在 2 ℃~8 ℃条件下可储存二周。
A.3 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂
A.3.1 成分
GB 4789.5-2012
9
酵母膏  3 .0 g
L-赖氨酸  5.0 g
木糖  3.75 g
乳糖  7.5 g
蔗糖  7.5 g
脱氧胆酸钠 1.0 g
氯化钠  5.0 g
硫代硫酸钠 6.8 g
柠檬酸铁铵 0.8 g
酚红 0.08 g
琼脂  15.0 g
蒸馏水  1 000.0 mL
A.3.2 制法
除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，校正 pH 至 7.40.2。另将琼脂加
入 600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至 50 ℃~55 ℃倾注平皿。
注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天
制备，第二天使用。使用前必须去除平板表面上的水珠，在 37 ℃～55 ℃温度下，琼脂面向下、平板盖亦向下烘干。另外
如配制好的培养基不立即使用，在 2 ℃~8 ℃条件下可储存二周。
A.4 三糖铁（TSI）琼脂
A.4.1 成分
蛋白胨  20.0 g
牛肉浸膏  5.0 g
乳糖  10.0 g
蔗糖  10.0 g
葡萄糖  1.0 g
硫酸亚铁铵 (NH 4 ) 2 Fe(SO 4 ) 2 ·6H 2 O 0.2 g
氯化钠 5.0 g
硫代硫酸钠 0.2 g
酚红  0.025 g
琼脂  12.0 g
蒸馏水  1 000.0 mL
A.4.2 制法
除酚红和琼脂外，将其他成分加于 400 mL 蒸馏水中,搅拌均匀,静置约 10 min,加热使完全溶化, 冷却
至 25 ℃左右校正 pH 至 7.40.2。另将琼脂加于 600 mL 蒸馏水中，静置约 10 min，加热使完全溶化。将
两溶液混合均匀，加入 5%酚红水溶液 5 mL，混匀，分装小号试管，每管约 3 mL。于 121 ℃灭菌 15 min，
制成高层斜面。冷却后呈桔红色。如不立即使用，在 2 ℃~8 ℃条件下可储存一个月。
A.5 营养琼脂斜面
A.5.1 成分
蛋白胨  10.0 g
牛肉膏  3.0 g
氯化钠  5.0 g
琼脂  15.0 g
GB 4789.5-2012
10
蒸馏水  1 000.0 mL
A.5.2 制法
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入 15%氢氧化钠溶液约 2 mL，冷却至 25 ℃左右校正 pH
至 7.00.2。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装小号试管，每管约 3 mL。于 121 ℃灭菌 15 min，
制成斜面。
注：如不立即使用，在 2℃ ~8 ℃条件下可储存二周。
A.6 半固体琼脂
A.6.1 成分
蛋白胨  1 . 0 g
牛肉膏  0.3 g
氯化钠  0.5 g
琼脂  0.3g～0.7g
蒸馏水  100.0 mL
A.6.2 制法
按以上成分配好，加热溶解，并校正pH至 7.40.2，分装小试管，121 ℃灭菌 15 min，直立凝固备
用。
A.7 葡萄糖铵培养基
A.7.1 成分
氯化钠  5.0 g
硫酸镁（MgSO4·7H 2 O）  0.2 g
磷酸二氢铵  1.0 g
磷酸氢二钾  1.0 g
葡萄糖  2.0 g
琼脂  20.0 g
0.2%溴麝香草酚蓝水溶液  40.0 mL
蒸馏水  1 000.0 mL
A.7.2 制法
先将盐类和糖溶解于水内，校正pH至6.80.2，再加琼脂加热溶解，然后加入指示剂。混合均匀后
分装试管，121 ℃高压灭菌15 min。制成斜面备用。
A.7.3 试验方法
用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不到混浊，以每一接种环
内含菌数在 20~100 之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接种普通斜面一支作为对
照。于 36 ℃1 ℃培养 24 h。阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的菌落生长；阴性者不生长，但在对照
培养基上生长良好。如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。
注：容器使用前应用清洁液浸泡。再用清水、蒸馏水冲洗干净，并用新棉花做成棉塞，干热灭菌后使用。如果操作时
不注意，有杂质污染时，易造成假阳性的结果。
A.8 尿素琼脂
A.8.1 成分
蛋白胨  1 . 0 g
氯化钠  5.0 g
葡萄糖  1.0 g
磷酸二氢钾  2.0 g
0.4%酚红溶液 3 .0mL
GB 4789.5-2012
11
琼脂  20.0 g
20%尿素溶液  100 .0mL
蒸馏水  900.0 mL
A.8.2 制法
除酚红和尿素外的其他成分加热溶解，冷却至25 ℃左右校正pH至7.20.2，加入酚红指示剂，混匀，
于121 ℃灭菌15 min。冷至约55 ℃，加入用0.22 μm过滤膜除菌后的20%尿素水溶液100 mL，混匀，以
无菌操作分装灭菌试管，每管约3 mL~4 mL，制成斜面后放冰箱备用。
A.8.3 试验方法
挑取琼脂培养物接种，在 36 ℃1 ℃培养 24 h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为
红色。
A.9 β-半乳糖苷酶培养基
A.9.1 液体法（ONPG法）
A.9.1.1 成分
邻硝基苯 β-D-半乳糖苷(ONPG)  60.0 mg
0.01 mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.50.2)  10.0 mL
1%蛋白胨水(pH7.50.2)  30.0 mL
A.9.1.2 制法
将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10 mm×75 mm试管内，每管0.5 mL，
用橡皮塞塞紧。
A.9.1.3 试验方法
自琼脂斜面挑取培养物一满环接种，于36 ℃1 ℃培养1 h~3 h和24 h观察结果。如果β-D-半乳糖苷
酶产生，则于1 h~3 h变黄色，如无此酶则24 h不变色。
A.9.2 平板法（X-Gal法）
A.9.2.1 成分
蛋白胨  20.0 g
氯化钠  3.0 g
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)  200.0 mg
琼脂  15.0 g
蒸馏水 1 000.0 mL
A.9.2.2 制法
将各成分（A.9.2.1）加热煮沸于1 L水中，冷却至25 ℃左右校正pH至7.20.2，115 ℃高压灭菌10 min。
倾注平板避光冷藏备用。
A.9.2.3 试验方法
挑取琼脂斜面培养物接种于平板，划线和点种均可，于36 ℃1 ℃培养18 h~24 h观察结果。如果
β-D-半乳糖苷酶产生，则平板上培养物颜色变蓝色，如无此酶则培养物为无色或不透明色，培养48 h~72
h后有部分转为淡粉红色。
A.10 氨基酸脱羧酶试验培养基
A.10.1 成分
蛋白胨  5.0 g
酵母浸膏  3.0 g
葡萄糖 1.0 g
1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液 1.0 mL
L型或DL型赖氨酸和鸟氨酸  0.5 g/100 mL 或 1.0 g/100 mL
GB 4789.5-2012
12
蒸馏水 1 000.0 mL
A.10.2 制法
除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶 100 mL，分别加入赖氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按 0.5%
加入，DL-氨基酸按 1%加入，再校正 pH 至 6.8±0.2。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，
每管 0.5 mL，上面滴加一层石蜡油，115 ℃高压灭菌 10 min。
A.10.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种，于 36 ℃1 ℃培养 18 h～24 h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由
于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。阴性对照管应为
黄色，空白对照管为紫色。
A.11 糖发酵管
A.11.1 成分
牛肉膏 5.0 g
蛋白胨  10.0 g
氯化钠 3.0 g
磷酸氢二钠（NA 2 HPO 4 ·12H 2 O）  2.0 g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液  12.0 mL
蒸馏水 1 000.0 mL
A.11.2 制法
A.11.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，25 ℃左右校正pH至7.4±0.2，分装于有
一个倒置小管的小试管内，121 ℃高压灭菌15 min。
A.11.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100 mL，121 ℃高压灭菌15 min。另将各种糖
类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5 mL糖溶液加入于100 mL培养基内，以无菌操作分装小试管。
注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。
A.11.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36 ℃1 ℃培养，一般观察2 d~3 d。迟缓反应需观察14 d~30 d。
A.12 西蒙氏柠檬酸盐培养基
A.12.1 成分
氯化钠  5.0 g
硫酸镁（MgSO4·7H 2 O）  0.2 g
磷酸二氢铵  1.0 g
磷酸氢二钾  1.0 g
柠檬酸钠  5.0 g
琼脂  20 g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液  40.0 mL
蒸馏水  1 000.0 mL
A.12.2 制法
先将盐类溶解于水内，调至pH 6.80.2，加入琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后分装
试管，121℃灭菌15 min。制成斜面备用。
A.12.3 试验方法
挑取少量琼脂培养物接种，于36 ℃1 ℃培养4 d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养
基从绿色转为蓝色。
A.13 粘液酸盐培养基
A.13.1 测试肉汤
GB 4789.5-2012
13
A.13.1.1 成分
酪蛋白胨 10.0 g
溴麝香草酚蓝溶液 0.024 g
蒸馏水 1 000.0 mL
粘液酸 10.0 g
A.13.1.2 制法
慢慢加入5 N氢氧化钠以溶解粘液酸，混匀。
其余成分加热溶解，加入上述粘液酸，冷却至25 ℃左右校正pH至7.4±0.2，分装试管，每管约5
mL，于121 ℃高压灭菌10 min。
A.13.2 质控肉汤
A.13.2.1 成分
酪蛋白胨 10.0 g
溴麝香草酚蓝溶液 0.024 g
蒸馏水 1 000.0 mL
A.13.2.2 制法
所有成分加热溶解，冷却至25 ℃左右校正pH至7.4±0.2，分装试管，每管约5 mL，于121 ℃高压灭菌
10 min。
A 13.3 试验方法
将待测新鲜培养物接种测试肉汤（A.13.1）和质控肉汤（A.13.2），于36 ℃1 ℃培养48 h观察结果，
肉汤颜色蓝色不变则为阴性结果，黄色或稻草黄色为阳性结果。
A.14 蛋白胨水、靛基质试剂
A.14.1成分
蛋白胨(或胰蛋白胨) 20.0 g
氯化钠 5.0 g
蒸馏水 1 000.0 mL
pH7.4 
A.14.2 制法
按上述成分配制，分装小试管，121 ℃高压灭菌 15 min。
注：此试剂在 2 ℃~8 ℃条件下可储存一个月。
A.14.3 靛基质试剂
A.14.3.1 柯凡克试剂：将 5 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 75 mL 戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸 25 mL。
A.14.3.2 欧－波试剂：将 1 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 95 mL 95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸 20 mL。
A.14.4 试验方法
挑取少量培养物接种，在36 ℃±1 ℃培养1 d～2 d，必要时可培养4 d～5 d。加入柯凡克试剂约0.5 mL，
轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧－波试剂约 0.5 mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，
阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用，此试剂在 2 ℃～8 ℃条
件下可储存一个月。