GB/T 4789.6-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希式菌检验

[所属分类:GB/T 4789] [发布时间:2019-8-9] [发布人:wwxa] [阅读次数:] [返回]

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
GB4789. 6 — 2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验
致泻大肠埃希氏菌检验
2016-12-23 发布 2017-06-23 实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局
发 布
GB4789. 6 — 2016
Ⅰ
前 言
本标准代替 GB / T4789. 6 — 2003 《食品卫生微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》。
本标准与 GB / T4789.
6 — 2003 相比,主要变化如下:
———标准名称修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验”;
———增加了术语和定义、缩略语;
———增加了血清学试验中 H 抗原鉴定;
———增加了 PCR 确认试验;
———增加了附录 A ;
———修改了设备和材料;
———修改了培养基和试剂;
———修改了检验程序;
———修改了血清学试验中致泻大肠埃希氏菌所包括的 O 抗原群;
———删除了肠毒素试验。
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1
食品安全国家标准
食品微生物学检验
致泻大肠埃希氏菌检验
1  范围
本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌(
diarrheagenic Escherichiacoli )的检验方法。
本标准适用于食品中致泻大肠埃希氏菌的检验。
2  术语和定义、缩略语
2. 1  术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2. 1. 1  致泻大肠埃希氏菌 Diarrheagenic Escherichiacoli
一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌,可经过污染食物引起人类发病。常见的致泻大
肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、产
志贺毒素大肠埃希氏菌(包括肠道出血性大肠埃希氏菌)和肠道集聚性大肠埃希氏菌。
2. 1. 2  肠道致病性大肠埃希氏菌 Enteropathogenic Escherichiacoli
能够引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤,且不产生志贺毒素的大肠埃希氏菌。该菌是婴
幼儿腹泻的主要病原菌,有高度传染性,严重者可致死。
2. 1. 3  肠道侵袭性大肠埃希氏菌 Enteroinvasive Escherichiacoli
能够侵入肠道上皮细胞而引起痢疾样腹泻的大肠埃希氏菌。该菌无动力、不发生赖氨酸脱羧反应、
不发酵乳糖,生化反应和抗原结构均近似痢疾志贺氏菌。侵入上皮细胞的关键基因是侵袭性质粒上的
抗原编码基因及其调控基因,如 ipaH 基因、
ipaR 基因(又称为 invE 基因)。
2. 1. 4  产肠毒素大肠埃希氏菌 Enterotoxigenic Escherichiacoli
能够分泌热稳定性肠毒素或/和热不稳定性肠毒素的大肠埃希氏菌。该菌可引起婴幼儿和旅游者
腹泻,一般呈轻度水样腹泻,也可呈严重的霍乱样症状,低热或不发热。腹泻常为自限性,一般 2d~3d
即自愈。
2. 1. 5  产志贺毒素大肠埃希氏菌 Shigatoxin-producing Escherichiacoli (肠道出血性大肠埃希氏菌
Enterohemorrhagic Escherichiacoli )
能够分泌志贺毒素、引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤的大肠埃希氏菌。有些产志贺毒
素大肠埃希氏菌在临床上引起人类出血性结肠炎( HC )或血性腹泻,并可进一步发展为溶血性尿毒综
合征( HUS ),这类产志贺毒素大肠埃希氏菌为肠道出血性大肠埃希氏菌。
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2
2. 1. 6  肠道集聚性大肠埃希氏菌 Enteroaggregative Escherichiacoli
肠道集聚性大肠埃希氏菌不侵入肠道上皮细胞,但能引起肠道液体蓄积。不产生热稳定性肠毒素
或热不稳定性肠毒素,也不产生志贺毒素。唯一特征是能对 Hep-2 细胞形成集聚性黏附,也称 Hep-2
细胞黏附性大肠埃希氏菌。
2. 2  缩略语
下列缩略语适用于本文件。
2. 2. 1 DEC :致泻大肠埃希氏菌 Diarrheagenic Escherichiacoli
2. 2. 2 EPEC :肠道致病性大肠埃希氏菌 Enteropathogenic Escherichiacoli
2. 2. 3 EIEC :肠道侵袭性大肠埃希氏菌 Enteroinvasive Escherichiacoli
2. 2. 4 ETEC :产肠毒素大肠埃希氏菌 Enterotoxigenic Escherichiacoli
2. 2. 5 STEC :产志贺毒素大肠埃希氏菌 Shigatoxin-producing Escherichiacoli
2. 2. 6 EHEC :肠道出血性大肠埃希氏菌 Enterohemorrhagic Escherichiacoli
2. 2. 7 EAEC :肠道集聚性大肠埃希氏菌 Enteroaggregative Escherichiacoli
2. 2. 8  escV :蛋白分泌物调节基因, geneencodingLEE-encodedtypeⅢsecretionsystemfactor
2. 2. 9  eae :紧密素基因, geneencodingintiminfor Escherichiacoli attachingandeffacing
2. 2. 10  bfpB :束状菌毛 B 基因, bundle-formingpilusB ;
2. 2. 11  stx 1 :志贺毒素 Ⅰ 基因, Shigatoxinone
2. 2. 12  stx 2 :志贺毒素 Ⅱ 基因, Shigatoxintwo
2. 2. 13  lt :热不稳定性肠毒素基因, heat-labileenterotoxin
2. 2. 14  st :热稳定性肠毒素基因, heat-stableenterotoxin
2. 2.15
stp
(
stIa ):猪源热稳定性肠毒素基因, heat-stableenterotoxinsinitiallydiscoveredinthe
isolatesfrompigs
2. 2. 16  sth ( stIb ):人 源 热 稳 定 性 肠 毒 素 基 因, heat-stableenterotoxinsinitiallydiscoveredinthe
isolatesfromhuman
2. 2. 17  invE :侵袭性质粒调节基因, invasiveplasmidregulator
2. 2. 18  ipaH :侵袭性质粒抗原 H 基因, invasiveplasmidantigenH-gene
2. 2. 19  aggR :集聚黏附菌毛调节基因, aggregativeadhesivefimbriaeregulator
2. 2. 20  uidA :
β
- 葡萄糖苷酶基因,
β
-glucuronidasegene
2. 2. 21  astA :集聚热稳定性毒素 A 基因, enteroaggregativeheat-stableenterotoxinA
2. 2. 22
pic
:肠定植因子基因,
proteininvolvedinintestinalcolonization
2. 2. 23  LEE :肠细胞损伤基因座, Locusofenterocyteeffacement
2. 2. 24  EAF : EPEC 黏附因子, EPECadhesivefactor
3  设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
3. 1  恒温培养箱: 36℃±1℃ , 42℃±1℃ 。
3. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
3. 3  恒温水浴箱: 50℃±1℃ , 100℃ 或适配 1. 5mL 或 2. 0mL 金属浴( 95℃~100℃ )。
3. 4  电子天平:感量为 0. 1g 和 0. 01g 。
3. 5  显微镜: 10×~100× 。
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3. 6  均质器。
3. 7  振荡器。
3. 8  无菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度), 10mL (具 0. 1mL 刻度)或微量移液器及吸头。
3. 9  无菌均质杯或无菌均质袋:容量 500mL 。
3. 10  无菌培养皿:直径 90mm 。
3. 11 pH 计或精密
pH 试纸。
3. 12  微量离心管: 1. 5mL 或 2. 0mL 。
3. 13  接种环: 1 μ L 。
3. 14  低温高速离心机:转速 ≥13000r / min ,控温 4℃~8℃ 。
3. 15  微生物鉴定系统。
3. 16 PCR 仪。
3. 17  微量移液器及吸头: 0. 5 μ L~2 μ L , 2 μ L~20 μ L , 20 μ L~200 μ L , 200 μ L~1000 μ L 。
3. 18  水平电泳仪:包括电源、电泳槽、制胶槽(长度 >10cm )和梳子。
3. 19 8 联排管和 8 联排盖(平盖/凸盖)。
3. 20  凝胶成像仪。
4  培养基和试剂
4. 1  营养肉汤:见 A. 1 。
4. 2  肠道菌增菌肉汤:见 A. 2 。
4. 3  麦康凯琼脂( MAC ):见 A. 3 。
4. 4  伊红美蓝琼脂( EMB ):见 A. 4 。
4. 5  三糖铁( TSI )琼脂:见 A. 5 。
4. 6  蛋白胨水、靛基质试剂:见 A. 6 。
4. 7  半固体琼脂:见 A. 7 。
4. 8  尿素琼脂( pH7. 2 ):见 A. 8 。
4. 9  氰化钾( KCN )培养基:见 A. 9 。
4. 10  氧化酶试剂:见 A. 10 。
4. 11  革兰氏染色液:见 A. 11 。
4. 12 BHI 肉汤:见 A. 12 。
4. 13  福尔马林(含 38%~40% 甲醛)。
4. 14  鉴定试剂盒。
4. 15  大肠埃希氏菌诊断血清。
4. 16  灭菌去离子水。
4. 17 0. 85% 灭菌生理盐水。
4. 18 TE ( pH8. 0 ):见 A. 13 。
4. 19 10×PCR 反应缓冲液:见 A. 14 。
4. 20 25mmol
/ L MgCl
2 。
4. 21 dNTPs : dATP 、 dTTP 、 dGTP 、 dCTP 每种浓度为 2. 5mmol
/ L 。
4. 22 5U / LTaq 酶。
4. 23  引物。
4. 24 50×TAE 电泳缓冲液:见 A. 15 。
4. 25  琼脂糖。
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4. 26  溴化乙锭( EB )或其他核酸染料。
4. 27 6× 上样缓冲液:见 A. 16 。
4. 28 Marker :分子量包含 100bp 、 200bp 、 300bp 、 400bp 、 500bp 、 600bp 、 700bp 、 800bp 、 900bp 、
1000bp 、 1500bp 条带。
4. 29  致泻大肠埃希氏菌 PCR 试剂盒。
5  检验程序
致泻大肠埃希氏菌检验程序见图 1 。
图 1  致泻大肠埃希氏菌检验程序
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6  操作步骤
6. 1  样品制备
6. 1. 1  固态或半固态样品
固体或半固态样品,以无菌操作称取检样 25g ,加入装有 225mL 营养肉汤的均质杯中,用旋转刀
片式均质器以 8000r / min~10000r / min 均质 1min~2min ;或加入装有 225mL 营养肉汤的均质袋
中,用拍击式均质器均质 1min~2min 。
6. 1. 2  液态样品
以无菌操作量取检样 25mL ,加入装有 225mL 营养肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无
菌玻璃珠),振荡混匀。
6. 2  增菌
将 6.
1 制备的样品匀液于 36℃±1℃ 培养 6h 。取 10 μ L ,接种于 30mL 肠道菌增菌肉汤管内,于
42℃±1℃ 培养 18h 。
6. 3  分离
将增菌液划线接种 MAC 和 EMB 琼脂平板,于 36 ℃±1 ℃ 培养 18h~24h ,观察菌落特征。在
MAC 琼脂平板上,分解乳糖的典型菌落为砖红色至桃红色,不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色;在
EMB 琼脂平板上,分解乳糖的典型菌落为中心紫黑色带或不带金属光泽,不分解乳糖的菌落为无色或
淡粉色。
6. 4  生化试验
6. 4. 1  选取平板上可疑菌落 10 个 ~20 个( 10 个以下全选),应挑取乳糖发酵,以及乳糖不发酵和迟缓
发酵的菌落,分别接种 TSI 斜面。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、尿素琼脂(
pH7. 2
)和 KCN 肉
汤。于 36℃±1℃ 培养 18h~24h 。
6. 4. 2 TSI 斜面产酸或不产酸,底层产酸,靛基质阳性, H 2 S 阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏
菌。 TSI 斜面底层不产酸,或
H 2 S 、 KCN 、尿素有任一项为阳性的培养物,均非大肠埃希氏菌。必要时
做革兰氏染色和氧化酶试验。大肠埃希氏菌为革兰氏阴性杆菌,氧化酶阴性。
6. 4. 3  如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统,可从营养琼脂平板上挑取经纯化的可疑菌落用无菌
稀释液制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。
6. 5 PCR 确认试验
6. 5. 1  取生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行 PCR 确认试验。
注: PCR 实验室区域设计、工作基本原则及注意事项应参照《疾病预防控制中心建设标准》(建标 127
— 2009 )和国家
卫生和计划生育委员会(原卫生部)(
2010 )《医疗机构临床基因扩增管理办法》附录(医疗机构临床基因扩增检
验实验室工作导则)。
6. 5. 2  使用 1 μ L 接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养 18h~24h 的菌落,悬浮在 200 μ L0. 85% 灭
菌生理盐水中,充分打散制成菌悬液,于 13000r / min 离心 3min ,弃掉上清液。加入 1mL 灭菌去离子
水充分混匀菌体,于 100℃ 水浴或者金属浴维持 10min ;冰浴冷却后,
13000r / min 离心 3min ,收集上
清液;按 1∶10 的比例用灭菌去离子水稀释上清液,取 2 μ L 作为 PCR 检测的模板;所有处理后的 DNA
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模板直接用于 PCR 反应或暂存于 4 ℃ 并当天进行 PCR 反应;否则,应在 -20 ℃ 以下保存备用( 1 周
内)。也可用细菌基因组提取试剂盒提取细菌 DNA ,操作方法按照细菌基因组提取试剂盒说明书进行。
6. 5. 3  每次 PCR 反应使用 EPEC 、 EIEC 、 ETEC 、 STEC / EHEC 、 EAEC 标准菌株作为阳性对照。同时,
使用大肠埃希氏菌 ATCC25922 或等效标准菌株作为阴性对照,以灭菌去离子水作为空白对照,控制
PCR 体系污染。致泻大肠埃希氏菌特征性基因见表 1 。
表 1  五种致泻大肠埃希氏菌特征基因
致泻大肠埃希氏菌类别 特征性基因
EPEC escV 或 eae 、 bfpB
STEC / EHEC escV 或 eae 、 stx 1 、 stx 2
EIEC invE 或 ipaH
ETEC lt 、
stp
、
sth
EAEC astA 、 aggR 、
pic
uidA
6. 5. 4 PCR 反应体系配制。每个样品初筛需配置 12 个 PCR 扩增反应体系,对应检测 12 个目标基因,
具体操作如下:使用 TE 溶液(
pH8. 0 )将合成的引物干粉稀释成 100 μ mol /
L 储存液。根据表 2 中每种
目标基因对应 PCR 体系内引物的终浓度,使用灭菌去离子水配制 12 种目标基因扩增所需的 10× 引物
工作液(以 uidA 基因为例,如表 3 )。将 10× 引物工作液、 10×PCR 反应缓冲液、 25mmol / L MgCl
2 、
2. 5mmol
/ LdNTPs 、灭菌去离子水从 -20 ℃ 冰箱中取出,融化并平衡至室温,使用前混匀;
5U / μ L
Taq
酶在加样前从 -20℃ 冰箱中取出。每个样品按照表 4 的加液量配制 12 个 25 μ L 反应体系,分别
使用 12 种目标基因对应的 10× 引物工作液。
表 2  五种致泻大肠埃希氏菌目标基因引物序列及每个 PCR 体系内的终浓度 c
引物
名称
引物序列 c
菌株编号及对应
Genbank 编码
引物所在位置
终浓度 n
(
μ mol
/ L )
PCR 产物
长度(
bp
)
uidA -F
5 ’ -ATG CCA GTC CAG CGT
TTTTGC-3 ’
Escherichiacoli
DH1Ec169 ( accessionno.
CP012127. 1 )
1673870-1673890 0. 2
1487
uidA -R
5 ’ -AAA GTG TGG GTC AAT
AATCAGGAAGTG-3 ’
1675356-1675330 0. 2
escV -F
5 ’ -ATT CTG GCT CTC TTC
TTCTTTATGGCTG-3 ’
Escherichiacoli
E2348 / 69 ( accessionno.
FM180568. 1 )
4122765-4122738 0. 4
544
escV -R
5 ’ -CGT CCC CTT TTA CAA
ACTTCATCGC-3 ’
4122222-4122246 0. 4
eae -F
a
5 ’ -ATT ACC ATC CAC ACA
GACGGT-3 ’ EHEC ( accessionno.
Z11541. 1 )
2651-2671 0. 2
397
eae -R
a
5 ’ -ACA GCG TGG TTG GAT
CAACCT-3 ’
3047-3027 0. 2
bfpB -F
5 ’ -GAC ACC TCA TTG CTG
AAGTCG-3 ’
Escherichiacoli
E2348 / 69 ( accession
no.FM180569. 1 )
3796-3816 0. 1 910
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表 2 (续)
引物
名称
引物序列 c
菌株编号及对应
Genbank 编码
引物所在位置
终浓度 n
(
μ mol
/ L )
PCR 产物
长度(
bp
)
bfpB -R
5 ’ -CCA GAA CAC CTC CGT
TATGC-3 ’
4702-4683 0. 1
stx 1-F
5 ’ -CGA TGT TAC GGT TTG
TTACTGTGACAGC-3 ’
stx 1-R
5 ’ -AAT GCC ACG CTT CCC
AGAATTG-3 ’
Escherichiacoli
EDL933 ( accessionno.
AE005174. 2 )
2996445-2996418 0. 2
2996202-2996223 0. 2
244
stx 2-F
5 ’ -GTT TTG ACC ATC TTC
GTCTGATTATTGAG-3 ’
stx 2-R
5 ’ -AGC GTA AGG CTT CTG
CTGTGAC-3 ’
Escherichiacoli
EDL933 ( accessionno.
AE005174. 2 )
1352543-1352571 0. 4
1352866-1352845 0. 4
324
lt -F
5 ’ -GAA CAG GAG GTT TCT
GCGTTAGGTG-3 ’
lt -R
5 ’ -CTT TCA ATG GCT TTT
TTTTGGGAGTC-3 ’
Escherichiacoli
E24377A ( accessionno.
CP000795. 1 )
17030-17054 0. 1
17684-17659 0. 1
655
stp
-F
5 ’ -CCT CTT TTA GYC AGA
CARCTGAATCASTTG-3 ’
stp
-R
5 ’ -CAG GCA GGA TTA CAA
CAAAGTTCACAG-3 ’
EscherichiacoliEC2173
(
accessionno.
AJ555214. 1 )///
EscherichiacoliF7682
(
accessionno.
AY342057. 1 )
1979-1950 /// 14-43 0. 4
1823-1849 /// 170-144 0. 4
157
sth -F
5 ’ -TGT CTT TTT CAC CTT
TCGCTC-3 ’
sth -R
5 ’ -CGG TAC AAG CAG GAT
TACAACAC-3 ’
Escherichiacoli
E24377A ( accession
no.CP000795. 1 )
11389-11409 0. 2
11559-11537 0. 2
171
invE -F
5 ’ -CGA TAG ATG GCG AGA
AATTATATCCCG-3 ’
invE -R
5 ’ -CGA TCA AGA ATC CCT
AACAGAAGAATCAC-3 ’
Escherichiacoli
serotypeO164
(
accessionno.
AF283289. 1 )
921-895 0. 2
156-184 0. 2
766
ipaH -F
b
5 ’ -TTG ACC GCC TTT CCG
ATACC-3 ’
Escherichiacoli53638
(
accessionno.
CP001064. 1 )
11471-11490 0. 1 647
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表 2 (续)
引物
名称
引物序列 c
菌株编号及对应
Genbank 编码
引物所在位置
终浓度 n
(
μ mol
/ L )
PCR 产物
长度(
bp
)
ipaH -R
b
5 ’ -ATC CGC ATC ACC GCT
CAGAC-3 ’
12117-12098 0. 1
aggR -F
5 ’ -ACG CAG AGT TGC CTG
ATAAAG-3 ’
aggR -R
5 ’ -AAT ACA GAA TCG TCA
GCATCAGC-3 ’
Escherichiacoli
enteroaggregative17-2
(
accessionno.Z18751. 1 )
59-79 0. 2
458-436 0. 2
400
pic
-F
5 ’ -AGC CGT TTC CGC AGA
AGCC-3 ’
pic
-R
5 ’ -AAA TGT CAG TGA ACC
GACGATTGG-3 ’
Escherichiacoli042
(
accessionno.
AF097644. 1 )
3700-3682 0. 2
2590-2613 0. 2
1111
astA -F
5 ’ -TGC CAT CAA CAC AGT
ATATCCG-3 ’
astA -R
5 ’ -ACG GCT TTG TAG TCC
TTCCAT-3 ’
Escherichiacoli
ECOR33 ( accession
no.AF161001. 1 )
2-23 0. 4
103-83 0. 4
102
16 S
rDNA-F
5 ’ -GGA GGC AGC AGT GGG
AATA-3 ’
16 S
rDNA-R
5 ’ -TGA CGG GCG GTG TGT
ACAAG-3 ’
Escherichiacolistrain
ST2747 ( accessionno.
CP007394. 1 )
149585-149603 0. 25
150645-150626 0. 25
1062
a escV 和 eae 基因选作其中一个;
b invE 和 ipaH
基因选作其中一个;
c
表中不同基因的引物序列可采用可靠性验证的其他序列代替。
表 3  每种目标基因扩增所需 10× 引物工作液配制表
引物名称 体积/
μ L
100 μ mol / L uidA -F 10× n
100 μ mol / L uidA -R 10× n
灭菌去离子水
100-2× ( 10× n )
总体积
100
注: n ———每条引物在反应体系内的终浓度(详见表 2 )。
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表 4  五种致泻大肠埃希氏菌目标基因扩增体系配制表
试剂名称 加样体积/
μ L
灭菌去离子水
12. 1
10×PCR 反应缓冲液 2. 5
25mmol / L MgCl 2 2. 5
2. 5mmol / LdNTPs 3. 0
10× 引物工作液 2. 5
5U / μ LTaq 酶 0. 4
DNA 模板 2. 0
总体积
25
6. 5. 5 PCR 循环条件。预变性 94℃5min ;变性 94℃30s ,复性 63℃30s ,延伸 72℃1. 5min , 30 个
循环;
72℃ 延伸 5min 。将配制完成的 PCR 反应管放入 PCR 仪中,核查 PCR 反应条件正确后,启动反
应程序。
6. 5. 6  称量 4. 0g 琼脂糖粉,加入至 200mL 的 1×TAE 电泳缓冲液中,充分混匀。使用微波炉反复加
热至沸腾,直到琼脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待琼脂糖溶液冷却至 60℃ 左右时,加入溴化
乙锭( EB )至终浓度为 0.
5 μ g / mL ,充分混匀后,轻轻倒入已放置好梳子的模具中,凝胶长度要大于
10cm ,厚度宜为 3mm~5mm 。检查梳齿下或梳齿间有无气泡,用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中
的气泡。当琼脂糖凝胶完全凝结硬化后,轻轻拔出梳子,小心将胶块和胶床放入电泳槽中,样品孔放置
在阴极端。向电泳槽中加入 1×TAE 电泳缓冲液,液面高于胶面 1mm~2mm 。将 5 μ LPCR 产物与
1 μ L6× 上样缓冲液混匀后,用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔,小心上样于孔中;阳性对
照的 PCR 反应产物加入到最后一个泳道;第一个泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通电泳仪电源,
根据公式:电压 = 电泳槽正负极间的距离(
cm ) ×5V / cm 计算并设定电泳仪电压数值;启动电压开关,
电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准。电泳 30min~45min 后,切断电源。取出凝胶放入凝胶成像
仪中观察结果,拍照并记录数据。
6. 5. 7  结果判定。电泳结果中空白对照应无条带出现,阴性对照仅有 uidA 条带扩增,阳性对照中出现
所有目标条带,
PCR 试验结果成立。根据电泳图中目标条带大小,判断目标条带的种类,记录每个泳道
中目标条带的种类,在表 5 中查找不同目标条带种类及组合所对应的致泻大肠埃希氏菌类别。
表 5  五种致泻大肠埃希氏菌目标条带与型别对照表
致泻大肠埃希氏菌类别 目标条带的种类组合
EAEC aggR , astA ,
pic
中一条或一条以上阳性
EPEC bfpB ( + / - ), escV a ( + ), stx 1 ( - ), stx 2 ( - )
STEC / EHEC
escV a ( + / - ), stx 1 ( + ), stx 2 ( - ), bfpB ( - )
escV a ( + / - ), stx 1 ( - ), stx 2 ( + ), bfpB ( - )
escV a ( + / - ), stx 1 ( + ), stx 2 ( + ), bfpB ( - )
ETEC lt ,
stp
,
sth 中一条或一条以上阳性
EIEC invE b ( + )
uidA c ( + / - )
a 在判定 EPEC 或 SETC / EHEC 时, escV 与 eae 基因等效;
b
在判定 EIEC 时,
invE 与 ipaH 基因等效。
c 97%
以上大肠埃希氏菌为 uidA 阳性。
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6. 5. 8  如用商品化 PCR 试剂盒或多重聚合酶链反应( MPCR )试剂盒,应按照试剂盒说明书进行操作和
结果判定。
6. 6  血清学试验(选做项目)
6. 6. 1  取 PCR 试验确认为致泻大肠埃希氏菌的菌株进行血清学试验。
注:应按照生产商提供的使用说明进行 O 抗原和 H 抗原的鉴定。当生产商的使用说明与下面的描述可能有偏差
时,按生产商提供的使用说明进行。
6. 6. 2 O 抗原鉴定
6. 6. 2. 1  假定试验:挑取经生化试验和 PCR 试验证实为致泻大肠埃希氏菌的营养琼脂平板上的菌落,
根据致泻大肠埃希氏菌的类别,选用大肠埃希氏菌单价或多价 OK 血清做玻片凝集试验。当与某一种
多价 OK 血清凝集时,再与该多价血清所包含的单价 OK 血清做凝集试验。致泻大肠埃希氏菌所包括
的 O 抗原群见表 6 。如与某一单价 OK 血清呈现凝集反应,即为假定试验阳性。
6. 6. 2. 2  证实试验:用 0. 85% 灭菌生理盐水制备 O 抗原悬液,稀释至与 MacFarland3 号比浊管相当的
浓度。原效价为 1∶160~1∶320 的 O 血清,用 0.
5% 盐水稀释至 1∶40 。将稀释血清与抗原悬液于
10mm×75mm 试管内等量混合,做单管凝集试验。混匀后放于 50℃±1℃ 水浴箱内,经 16h 后观察
结果。如出现凝集,可证实为该 O 抗原。
表 6  致泻大肠埃希氏菌主要的 O 抗原
DEC 类别 DEC 主要的 O 抗原
EPEC O26O55O86O111abO114O119O125acO127O128abO142O158 等
STEC / EHEC O4O26O45O91O103O104O111O113O121O128O157 等
EIEC O28acO29O112acO115O124O135O136O143O144O152O164O167 等
ETEC
O6O11O15O20O25O26O27O63O78O85O114O115O128acO148O149O159
O166O167 等
EAEC O9O62O73O101O134 等
6. 6. 3 H 抗原鉴定
6. 6. 3. 1  取菌株穿刺接种半固体琼脂管, 36℃±1 ℃ 培养 18h~24h ,取顶部培养物 1 环接种至 BHI
液体培养基中,于 36℃±1℃ 培养 18h~24h 。加入福尔马林至终浓度为 0.
5% ,做玻片凝集或试管凝
集试验。
6. 6. 3. 2  若待测抗原与血清均无明显凝集,应从首次穿刺培养管中挑取培养物,再进行 2 次 ~3 次半固
体管穿刺培养,按照 6.
6. 3. 1 进行试验。
7  结果报告
7. 1  根据生化试验、 PCR 确认试验的结果,报告 25g (或 25mL )样品中检出或未检出某类致泻大肠埃
希氏菌。
7. 2  如果进行血清学试验,根据血清学试验的结果,报告 25g (或 25mL )样品中检出的某类致泻大肠
埃希氏菌血清型别。
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附 录 A
培养基和试剂
A. 1  营养肉汤
A. 1. 1  成分
蛋白胨 10.
0g
牛肉膏
3. 0g
氯化钠
5. 0g
蒸馏水
1000mL
A. 1. 2  制法
将以上成分混合加热溶解,冷却至 25℃ 左右校正
pH
至 7.
4±0. 2 ,分装适当的容器。 121 ℃ 灭菌
15min 。
A. 2  肠道菌增菌肉汤
A. 2. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
葡萄糖
5. 0g
牛胆盐
20. 0g
磷酸氢二钠
8. 0g
磷酸二氢钾
2. 0g
煌绿
0. 015g
蒸馏水
1000mL
A. 2. 2  制法
将以上成分混合加热溶解,冷却至 25℃ 左右校正
pH
至 7.
2±0. 2 ,分装每瓶 30mL 。 115 ℃ 灭菌
20min 。
A. 3  麦康凯琼脂( MAC )
A. 3. 1  成分
蛋白胨
20. 0g
乳糖
10. 0g
3 号胆盐 1. 5g
氯化钠
5. 0g
中性红
0. 03g
结晶紫
0. 001g
琼脂
15. 0g
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蒸馏水
1000mL
A. 3. 2  制法
将以上成分混合加热溶解,校正
pH
至 7.
2±0. 2 。 121℃ 高压灭菌 15min 。冷却至 45℃~50℃ ,
倾注平板。
注:如不立即使用,在 2℃~8℃ 条件下可储存两周。
A. 4  伊红美蓝( EMB )琼脂
A. 4. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
乳糖
10. 0g
磷酸氢二钾( K
2 HPO 4 ) 2. 0g
琼脂
15. 0g
2% 伊红 Y 水溶液 20. 0mL
0. 5% 美蓝水溶液 13. 0mL
蒸馏水
1000mL
A. 4. 2  制法
在 1000mL 蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和乳糖,加水补足,冷却至 25 ℃ 左右校正
pH
至
7. 1±0. 2 。再加入琼脂, 121℃ 高压灭菌 15min 。冷至 45℃~50℃ ,加入 2% 伊红 Y 水溶液和 0. 5% 美
蓝水溶液,摇匀,倾注平皿。
A. 5  三糖铁琼脂( TSI )
A. 5. 1  成分
蛋白胨
20. 0g
牛肉浸膏
5. 0g
乳糖
10. 0g
蔗糖
10. 0g
葡萄糖
1. 0g
硫酸亚铁铵[( NH 4 )
2 Fe ( SO 4 ) 2 · 6H 2 O ] 0. 2g
氯化钠
5. 0g
硫代硫酸钠
0. 2g
酚红
0. 025g
琼脂
12. 0g
蒸馏水
1000mL
A. 5. 2  制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加于 400mL 水中,搅拌均匀,静置约 10min ,加热使完全溶化,冷却
至 25℃ 左右校正
pH
至 7.
4±0. 2 。另将琼脂加于 600mL 水中,静置约 10min ,加热使完全溶化。将
两溶液混合均匀,加入 5% 酚红水溶液 5 mL ,混匀,分装小号试管,每管约 3 mL 。于 121 ℃ 灭菌
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15min ,制成高层斜面。冷却后呈桔红色。如不立即使用,在 2℃~8℃ 条件下可储存一个月。
A. 6  蛋白胨水、靛基质试剂
A. 6. 1  成分
胰蛋白胨
20. 0g
氯化钠
5. 0g
蒸馏水
1000mL
A. 6. 2  制法
将以上成分混合加热溶解,冷却至 25 ℃ 左右校正
pH
至 7.
4±0. 2 ,分装小试管, 121 ℃ 高压灭菌
15min 。
注:此试剂在 2℃~8℃ 条件下可储存一个月。
A. 6. 3  靛基质试剂
A. 6. 3. 1  柯凡克试剂:将 5g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 75mL 戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸 25mL 。
A. 6. 3. 2  欧 - 波试剂:将 1g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 95 mL95% 乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸
20mL 。
A. 6. 4  试验方法
挑取少量培养物接种,在 36℃±1℃ 培养 1d~2d ,必要时可培养 4d~5d 。加入柯凡克试剂约
0. 5mL ,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧 - 波试剂约 0. 5mL ,沿管壁流下,覆盖于培养液
表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
A. 7  半固体琼脂
A. 7. 1  成分
蛋白胨
1. 0g
牛肉膏
0. 3g
氯化钠
0. 5g
琼脂
0. 3g~0. 5g
蒸馏水
100. 0mL
A. 7. 2  制法
按以上成分配好,加热溶解,冷却至 25 ℃ 左右校正
pH
至 7.
4±0. 2 ,分装小试管。 121 ℃ 灭菌
15min ,直立凝固备用。
A. 8  尿素琼脂( pH7. 2 )
A. 8. 1  成分
蛋白胨
1. 0g
氯化钠
5. 0g
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葡萄糖
1. 0g
磷酸二氢钾
2. 0g
0. 4% 酚红 3. 0mL
琼脂
20. 0g
20% 尿素溶液 100. 0mL
蒸馏水
1000mL
A. 8. 2  制法
除酚红、尿素和琼脂外的其他成分加热溶解,冷却至 25℃ 左右校正
pH
至 7.
2±0. 2 ,加入酚红指示
剂,混匀,于 121℃ 灭菌 15min 。冷至约 55℃ ,加入用 0.
22 μ m 过滤膜除菌后的 20% 尿素水溶液 100
mL ,混匀,以无菌操作分装灭菌试管,每管约 3mL~4mL ,制成斜面后放冰箱备用。
A. 8. 3  试验方法
挑取琼脂培养物接种,在 36℃±1℃ 培养 24h ,观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变
为红色。
A. 9  氰化钾( KCN )培养基
A. 9. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
氯化钠
5. 0g
磷酸二氢钾
0. 225g
磷酸氢二钠
5. 64g
0. 5% 氰化钾 20. 0mL
蒸馏水
1000mL
A. 9. 2  制法
将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,分装后 121℃ 高压灭菌 15min 。放在冰箱内使
其充分冷却。每 100mL 培养基加入 0.
5% 氰化钾溶液 2. 0mL (最后浓度为 1∶10000 ),分装于无菌试
管内,每管约 4mL ,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在 4℃ 冰箱内,至少可保存两个月。同时,将不加氰化钾
的培养基作为对照培养基,分装试管备用。
A. 9. 3  试验方法
将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液,挑取 1 环接种于氰化钾( KCN )培养基。并另挑取
1 环接种于对照培养基。在 36℃±1℃ 培养 1d~2d ,观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制),经
2d 细菌不生长为阴性(抑制)。
注:氰化钾是剧毒药,使用时应小心,切勿沾染,以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原
因是封口不严,氰化钾逐渐分解,产生氢氰酸气体逸出,以致药物浓度降低,细菌生长,因而造成假阳性反应。
试验时对每一环节都要特别注意。
A. 10  氧化酶试剂
A. 10. 1  成分
N , N ’ - 二甲基对苯二胺盐酸盐或
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N , N , N ’, N ’ - 四甲基对苯二胺盐酸盐 1. 0g
蒸馏水
100mL
A. 10. 2  制法
少量新鲜配制,于 2℃~8℃ 冰箱内避光保存,在 7d 内使用。
A. 10. 3  试验方法
用无菌棉拭子取单个菌落,滴加氧化酶试剂,
10s 内呈现粉红或紫红色即为氧化酶试验阳性,不变
色者为氧化酶试验阴性。
A. 11  革兰氏染色液
A. 11. 1  结晶紫染色液
A. 11. 1. 1  成分
结晶紫
1. 0g
95% 乙醇 20. 0mL
1% 草酸铵水溶液 80. 0mL
A. 11. 1. 2  制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
A. 11. 2  革兰氏碘液
A. 11. 2. 1  成分
碘
1. 0g
碘化钾
2. 0g
蒸馏水
300mL
A. 11. 2. 2  制法
将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至 300mL 。
A. 11. 3  沙黄复染液
A. 11. 3. 1  成分
沙黄
0. 25g
95% 乙醇 10. 0mL
蒸馏水
90. 0mL
A. 11. 3. 2  制法
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
A. 11. 4  染色法
A. 11. 4. 1  涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染 1min ,水洗。
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A. 11. 4. 2  滴加革兰氏碘液,作用 1min ,水洗。
A. 11. 4. 3  滴加 95% 乙醇脱色约 15s~30s ,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。
A. 11. 4. 4  滴加复染液,复染 1min ,水洗、待干、镜检。
A. 12 BHI 肉汤
A. 12. 1  成分
小牛脑浸液
200g
牛心浸液
250g
蛋白胨
10. 0g
NaCl 5. 0g
葡萄糖
2. 0g
磷酸氢二钠( Na
2 HPO 4 ) 2. 5g
蒸馏水
1000mL
A. 12. 2  制法
按以上成分配好,加热溶解,冷却至 25 ℃ 左右校正
pH
至 7.4±0.
2 ,分装小试管。 121 ℃ 灭菌
15min 。
A. 13 TE ( pH8. 0 )
A. 13. 1  成分
1mol
/ LTris-HCl (
pH8. 0 )
10. 0mL
0. 5mol
/ LEDTA (
pH8. 0 )
2. 0mL
灭菌去离子水
988mL
A. 13. 2  制法
将 1mol / LTris-HCl 缓冲液(
pH8. 0 )、 0. 5mol / LEDTA 溶液(
pH8. 0 )加入约 800mL 灭菌去离子
水均匀,再定容至 1000mL ,
121℃ 高压灭菌 15min , 4℃ 保存。
A. 14 10×PCR 反应缓冲液
A. 14. 1  成分
1mol
/ LTris-HCl (
pH8. 5 )
840mL
氯化钾( KCl )
37. 25g
灭菌去离子水
160mL
A. 14. 2  制法
将氯化钾溶于 1mol / LTris-HCl (
pH8. 5 ),定容至 1000mL ,
121℃ 高压灭菌 15min ,分装后 -20℃
保存。
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A. 15 50×TAE 电泳缓冲液
A. 15. 1  成分
Tris 242. 0g
EDTA-2Na ( Na 2 EDTA · 2H 2 O ) 37. 2g
冰乙酸(
CH 3 COOH ) 57. 1mL
灭菌去离子水
942. 9mL
A. 15. 2  制法
Tris 和 EDTA-2Na 溶于 800mL 灭菌去离子水,充分搅拌均匀;加入冰乙酸,充分溶解;用 1mol
/ l
NaOH 调
pH
至 8.
3 ,定容至 1L 后,室温保存。使用时稀释 50 倍即为 1×TAE 电泳缓冲液。
A. 16 6× 上样缓冲液
A. 16. 1  成分
溴酚蓝
0. 5g
二甲苯氰 FF
0. 5g
0. 5mol
/ LEDTA (
pH8. 0 )
0. 06mL
甘油
360mL
灭菌去离子水
640mL
A. 16. 2  制法
0. 5mol
/ LEDTA (
pH8. 0 )溶于 500mL 灭菌去离子水中,加入溴酚蓝和二甲苯氰 FF 溶解,与甘油
混合,定容至 1000mL ,分装后 4℃ 保存。