- 定做培养基/定制培养基
- 颗粒培养基
- 标准菌株生化鉴定试剂盒
- 2020年版中国药典
- 促销/特价商品
- 院感/疾控/体外诊断/采样管
- 样品采集与处理(均质)产品
- 按标准检索培养基
- 预灌装即用型成品培养基
- 模拟灌装用培养基
- 干燥粉末培养基
- 培养基添加剂/补充剂
- 生化反应鉴定管
- 染色液等配套产品
- 对照培养基/标准品
- 实验耗材与器具
- 生化试剂/化学试剂
- 菌种鉴定服务
GB/T 4789
您现在的位置: 网站首页 >> GB/T 4789
GB/T 4789.11-2014 食品安全国家标准 食品微生物学检验 β型溶血性链球菌检验
[所属分类:GB/T 4789] [发布时间:2019-8-9] [发布人:wwxa] [阅读次数:] [返回]
中华人民共和国国家标准
GB 4789.11-2014
食品安全国家标准
食品微生物学检验 β 型溶血性链球菌检验
2014-12-01 发布 2015-05-01 实施
GB 4789.11—2014
I
前 言
本标准代替 GB/T 4789.11-2003《食品卫生微生物学检验 溶血性链球菌检验》。
本标准与GB/T 4789.11-2003 相比, 主要变化如下:
——修改了标准名称;
——修改了范围;
——增加了术语和定义;
——修改了设备与材料;
——修改了培养基与试剂;
——删除了以无菌生理盐水稀释样品的步骤和杆菌肽敏感试验;
——增加了触酶试验;
——增加了附录A。
GB 4789.11—2014
1
食品安全国家标准
食品微生物学检验 β 型溶血性链球菌检验
1 范围
本标准规定了食品中 β 型溶血性链球菌(Streptococcus)的检验方法。
本标准适用于食品中 β 型溶血性链球菌的检验。
2 术语和定义
2.1 β 型溶血
在菌落周围形成完全透明的溶血环,红细胞完全溶解。
2.2 β 型溶血性链球菌
能够产生 β 型溶血的化脓(或 A 群)链球菌(Streptococcus pyogenes)和无乳(或 B 群)链球菌
(Streptococcus agalactiae)。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
a) 恒温培养箱: 36 ℃±1 ℃;
b) 冰箱:2 ℃~5 ℃;
c) 厌氧培养装置;
d) 天平:感量 0.1 g;
e) 均质器与配套均质袋;
f) 显微镜:10 倍~100 倍;
g) 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头;
h) 无菌锥形瓶:容量 100 mL、200 mL、2 000 mL;
i) 无菌培养皿:直径 90 mm;
j) pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸;
k) 水浴装置:36 ℃±1 ℃;
l) 微生物生化鉴定系统。
4 培养基和试剂
4.1 改良胰蛋白胨大豆肉汤(Modified tryptone soybean broth, mTSB):见附录 A 中 A.1。
4.2 哥伦比亚 CNA 血琼脂(Columbia CNA blood agar):见附录 A 中 A.2。
4.3 哥伦比亚血琼脂(Columbia blood agar):见附录 A 中 A.3。
4.4 革兰氏染色液:见附录 A 中 A.4。
4.5 胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptone soybean broth, TSB):见附录 A 中 A.5。
4.6 草酸钾血浆:见附录 A 中 A.6。
GB 4789.11—2014
2
4.7 0.25%氯化钙(CaCl 2 )溶液:见附录 A 中 A.7。
4.8 3%过氧化氢(H 2 O 2 )溶液:见附录 A 中 A.8。
4.9 生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。
5 检验程序
溶血性链球菌检验程序见图 1。
图1 溶血性链球菌检验程序
6 操作步骤
6.1 样品处理及增菌
按无菌操作称取检样 25 g(mL),加入盛有 225 mL mTSB 的均质袋中,用拍击式均质器均质 1 min~
2 min;或加入盛有 225 mL mTSB 的均质杯中,以 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min。若样品为
液态,振荡均匀即可。36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。
6.2 分离
将增菌液划线接种于哥伦比亚 CNA 血琼脂平板,36 ℃±1 ℃厌氧培养 18 h~24 h,观察菌落形态。
溶血性链球菌在哥伦比亚 CNA 血琼脂平板上的典型菌落形态为直径约 2 mm~3 mm,灰白色、半透
18 h ~ 24 h
样品 25g(或 mL)+ 225 mL mTSB
划线接种哥伦比亚 CNA 血琼脂平板
革兰氏染色镜检/触酶试验
确定鉴定
生化鉴定 链激酶试验 (选做项目)
报 告
挑取可疑菌落,接种哥伦比亚血琼脂平板和 TSB
36 ℃±1 ℃
18 h~24 h ,厌氧培养
36 ℃±1 ℃
18 h~24 h
36 ℃±1 ℃
GB 4789.11—2014
3
明、光滑、表面突起、圆形、边缘整齐,并产生 β 型溶血。
6.3 鉴定
6.3.1 分纯培养
挑取 5 个(如小于 5 个则全选)可疑菌落分别接种哥伦比亚血琼脂平板和 TSB 增菌液, 36 ℃±1 ℃
培养 18 h~24 h。
6.3.2 革兰氏染色镜检
挑取可疑菌落染色镜检。β 型溶血性链球菌为革兰氏染色阳性,球形或卵圆形,常排列成短链状。
6.3.3 触酶试验
挑取可疑菌落于洁净的载玻片上,滴加适量 3%过氧化氢溶液,立即产生气泡者为阳性。β 型溶血性
链球菌触酶为阴性。
6.3.4 链激酶试验(选做项目)
吸取草酸钾血浆 0.2 mL 于 0.8 mL 灭菌生理盐水中混匀,再加入经 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h 的可
疑菌的 TSB 培养液 0.5 mL 及 0.25%氯化钙溶液 0.25 mL,振荡摇匀,置于 36 ℃±1 ℃水浴中 10 min,血
浆混合物自行凝固(凝固程度至试管倒置,内容物不流动)。继续 36 ℃±1 ℃培养 24 h,凝固块重新完全
溶解为阳性,不溶解为阴性,β 型溶血性链球菌为阳性。
6.3.5 其他检验
使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡对可疑菌落进行鉴定。
7 结果与报告
综合以上试验结果,报告每 25 g(mL)检样中检出或未检出溶血性链球菌。
GB 4789.11—2014
4
附录 A
培养基与试剂
A.1 改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Modified tryptone soybean broth, mTSB)
A.1.1 基础培养基(胰蛋白胨大豆肉汤 TSB)
A.1.1.1 成分
胰蛋白胨 17.0 g
大豆蛋白胨 3.0 g
氯化钠 5.0 g
磷酸二氢钾(无水) 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
蒸馏水 1000.0 mL
A.1.1.2 制法
将A.1.1.1中各成分溶于蒸馏水中,加热溶解,校正pH至7.3±0.2,121 ℃灭菌15 min,备用。
A.1.2 抗生素溶液
A.1.2.1 多黏菌素溶液
称取10 mg多黏菌素B于10 mL灭菌蒸馏水中,振摇混匀, 充分溶解后过滤除菌。
A.1.2.2 萘啶酮酸钠溶液
称取10 mg萘啶酮酸于10 mL 0.05 mol/L氢氧化钠溶液中,振摇混匀,充分溶解后过滤除菌。
A.1.3 完全培养基
A.1.3.1 成分
胰蛋白胨大豆肉汤(TSB) 1 000.0 mL
多黏菌素溶液 10.0 mL
萘啶酮酸钠溶液 10.0 mL
A.1.3.2 制法
无菌条件下,将A.1.3.1中各成分进行混合,充分混匀,分装备用。
A.2 哥伦比亚CNA血琼脂(Columbia CNA blood agar)
A.2.1 成分
胰酪蛋白胨 12.0 g
动物组织蛋白消化液 5.0 g
酵母提取物 3.0 g
牛肉提取物 3.0 g
GB 4789.11—2014
5
玉米淀粉 1.0 g
氯化钠 5.0 g
琼脂 13.5 g
多黏菌素 0.01 g
萘啶酸 0.01 g
蒸馏水 1000.0 mL
A.2.2 制法
将 A.2.1 中各成分溶于蒸馏水中,加热溶解,校正 pH 至 7.3 0.2,121 ℃灭菌 12 min,待冷却至
50 ℃左右时加 50 mL;无菌脱纤维绵羊血,摇匀后倒平板。
A.3 哥伦比亚血琼脂(Columbia blood agar)
A.3.1 基础培养基
A.3.1.1 成分
动物组织酶解物 23.0 g
淀粉 1.0 g
氯化钠 5.0 g
琼脂 8.0 g~18.0 g
蒸馏水 1 000.0 mL
A.3.1.2 制法
将基础培养基成分溶解于蒸馏水中,加热促其溶解。121 ℃高压灭菌 15 min。
A.3.2 无菌脱纤维绵羊血
无菌操作条件下,将绵羊血加入到盛有灭菌玻璃珠的容器中,振摇约 10 min,静置后除去附有血纤
维的玻璃珠即可。
A.3.3 完全培养基
A.3.3.1 组分
基础培养基 1 000.0 mL
无菌脱纤维绵羊血 50.0 mL
A.3.3.2 制法
当基础培养基的温度为 45 ℃左右时,无菌加入绵羊血,混匀。校正 pH 至 7.2±0.2。倾注 15 mL 于
无菌平皿中,静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超
过 4 h,或在 4 ℃冷藏不得超过 7 d。
A.4 革兰氏染色液
A.4.1 结晶紫染色液基础培养基
A.4.1.1 成分
GB 4789.11—2014
6
结晶紫 1.0 g
95%乙醇 20.0 mL
1%草酸铵水溶液 80.0 mL
A.4.1.2 制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
A.4.2 革兰氏碘液
A.4.2.1 成分
碘 1.0 g
碘化钾 2.0 g
蒸馏水 300.0 mL
A.4.2.2 制法
将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至 300 mL。
A.4.3 沙黄复染液
A.4.3.1 成分
沙黄 0.25 g
95%乙醇 10.0 mL
蒸馏水 90.0 mL
A.4.3.2 制法
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
A.4.4 染色操作步骤
将涂片在酒精灯火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染 1 min,水洗;滴加革兰氏碘液,作用 1 min,
水洗;滴加 95%乙醇脱色,约 15 s~30 s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗;滴加复染液,复
染 1 min,水洗后进行干燥,镜检。
A.5 胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptone soybean broth, TSB)
A.5.1 成分
胰蛋白胨 17.0 g
大豆蛋白胨 3.0 g
氯化钠 5.0 g
磷酸二氢钾(无水) 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
蒸馏水 1000.0 mL
A.5.2 制法
将A.5.1中各成分溶于蒸馏水中,加热溶解,校正pH至7.3±0.2,121 ℃灭菌15 min,分装备用。
GB 4789.11—2014
7
A.6 草酸钾血浆
A.6.1 成分
草酸钾 0.01 g
人血 5.0 mL
A.6.2 制法
草酸钾0.01 g放入灭菌小试管中,再加入5 mL人血,混匀,经离心沉淀,吸取上清液即为草酸钾血
浆。
A.7 0.25%氯化钙(CaCl 2 )溶液
A.7.1 成分
氯化钙(无水) 22.2 g
蒸馏水 1000.0 mL
A.7.2 制法
称取 22.2g 氯化钙(无水)溶于蒸馏水中,分装备用。
A.8 3%过氧化氢(H 2 O 2 )溶液
A.8.1 成分
30%过氧化氢(H 2 O 2 )溶液 100.0 mL
蒸馏水 900.0 mL
A.8.2 制法
吸取100mL 30%过氧化氢(H 2 O 2 )溶液,溶于蒸馏水中,混匀,分装备用。
GB 4789.11-2014
食品安全国家标准
食品微生物学检验 β 型溶血性链球菌检验
2014-12-01 发布 2015-05-01 实施
GB 4789.11—2014
I
前 言
本标准代替 GB/T 4789.11-2003《食品卫生微生物学检验 溶血性链球菌检验》。
本标准与GB/T 4789.11-2003 相比, 主要变化如下:
——修改了标准名称;
——修改了范围;
——增加了术语和定义;
——修改了设备与材料;
——修改了培养基与试剂;
——删除了以无菌生理盐水稀释样品的步骤和杆菌肽敏感试验;
——增加了触酶试验;
——增加了附录A。
GB 4789.11—2014
1
食品安全国家标准
食品微生物学检验 β 型溶血性链球菌检验
1 范围
本标准规定了食品中 β 型溶血性链球菌(Streptococcus)的检验方法。
本标准适用于食品中 β 型溶血性链球菌的检验。
2 术语和定义
2.1 β 型溶血
在菌落周围形成完全透明的溶血环,红细胞完全溶解。
2.2 β 型溶血性链球菌
能够产生 β 型溶血的化脓(或 A 群)链球菌(Streptococcus pyogenes)和无乳(或 B 群)链球菌
(Streptococcus agalactiae)。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
a) 恒温培养箱: 36 ℃±1 ℃;
b) 冰箱:2 ℃~5 ℃;
c) 厌氧培养装置;
d) 天平:感量 0.1 g;
e) 均质器与配套均质袋;
f) 显微镜:10 倍~100 倍;
g) 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头;
h) 无菌锥形瓶:容量 100 mL、200 mL、2 000 mL;
i) 无菌培养皿:直径 90 mm;
j) pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸;
k) 水浴装置:36 ℃±1 ℃;
l) 微生物生化鉴定系统。
4 培养基和试剂
4.1 改良胰蛋白胨大豆肉汤(Modified tryptone soybean broth, mTSB):见附录 A 中 A.1。
4.2 哥伦比亚 CNA 血琼脂(Columbia CNA blood agar):见附录 A 中 A.2。
4.3 哥伦比亚血琼脂(Columbia blood agar):见附录 A 中 A.3。
4.4 革兰氏染色液:见附录 A 中 A.4。
4.5 胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptone soybean broth, TSB):见附录 A 中 A.5。
4.6 草酸钾血浆:见附录 A 中 A.6。
GB 4789.11—2014
2
4.7 0.25%氯化钙(CaCl 2 )溶液:见附录 A 中 A.7。
4.8 3%过氧化氢(H 2 O 2 )溶液:见附录 A 中 A.8。
4.9 生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。
5 检验程序
溶血性链球菌检验程序见图 1。
图1 溶血性链球菌检验程序
6 操作步骤
6.1 样品处理及增菌
按无菌操作称取检样 25 g(mL),加入盛有 225 mL mTSB 的均质袋中,用拍击式均质器均质 1 min~
2 min;或加入盛有 225 mL mTSB 的均质杯中,以 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min。若样品为
液态,振荡均匀即可。36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。
6.2 分离
将增菌液划线接种于哥伦比亚 CNA 血琼脂平板,36 ℃±1 ℃厌氧培养 18 h~24 h,观察菌落形态。
溶血性链球菌在哥伦比亚 CNA 血琼脂平板上的典型菌落形态为直径约 2 mm~3 mm,灰白色、半透
18 h ~ 24 h
样品 25g(或 mL)+ 225 mL mTSB
划线接种哥伦比亚 CNA 血琼脂平板
革兰氏染色镜检/触酶试验
确定鉴定
生化鉴定 链激酶试验 (选做项目)
报 告
挑取可疑菌落,接种哥伦比亚血琼脂平板和 TSB
36 ℃±1 ℃
18 h~24 h ,厌氧培养
36 ℃±1 ℃
18 h~24 h
36 ℃±1 ℃
GB 4789.11—2014
3
明、光滑、表面突起、圆形、边缘整齐,并产生 β 型溶血。
6.3 鉴定
6.3.1 分纯培养
挑取 5 个(如小于 5 个则全选)可疑菌落分别接种哥伦比亚血琼脂平板和 TSB 增菌液, 36 ℃±1 ℃
培养 18 h~24 h。
6.3.2 革兰氏染色镜检
挑取可疑菌落染色镜检。β 型溶血性链球菌为革兰氏染色阳性,球形或卵圆形,常排列成短链状。
6.3.3 触酶试验
挑取可疑菌落于洁净的载玻片上,滴加适量 3%过氧化氢溶液,立即产生气泡者为阳性。β 型溶血性
链球菌触酶为阴性。
6.3.4 链激酶试验(选做项目)
吸取草酸钾血浆 0.2 mL 于 0.8 mL 灭菌生理盐水中混匀,再加入经 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h 的可
疑菌的 TSB 培养液 0.5 mL 及 0.25%氯化钙溶液 0.25 mL,振荡摇匀,置于 36 ℃±1 ℃水浴中 10 min,血
浆混合物自行凝固(凝固程度至试管倒置,内容物不流动)。继续 36 ℃±1 ℃培养 24 h,凝固块重新完全
溶解为阳性,不溶解为阴性,β 型溶血性链球菌为阳性。
6.3.5 其他检验
使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡对可疑菌落进行鉴定。
7 结果与报告
综合以上试验结果,报告每 25 g(mL)检样中检出或未检出溶血性链球菌。
GB 4789.11—2014
4
附录 A
培养基与试剂
A.1 改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Modified tryptone soybean broth, mTSB)
A.1.1 基础培养基(胰蛋白胨大豆肉汤 TSB)
A.1.1.1 成分
胰蛋白胨 17.0 g
大豆蛋白胨 3.0 g
氯化钠 5.0 g
磷酸二氢钾(无水) 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
蒸馏水 1000.0 mL
A.1.1.2 制法
将A.1.1.1中各成分溶于蒸馏水中,加热溶解,校正pH至7.3±0.2,121 ℃灭菌15 min,备用。
A.1.2 抗生素溶液
A.1.2.1 多黏菌素溶液
称取10 mg多黏菌素B于10 mL灭菌蒸馏水中,振摇混匀, 充分溶解后过滤除菌。
A.1.2.2 萘啶酮酸钠溶液
称取10 mg萘啶酮酸于10 mL 0.05 mol/L氢氧化钠溶液中,振摇混匀,充分溶解后过滤除菌。
A.1.3 完全培养基
A.1.3.1 成分
胰蛋白胨大豆肉汤(TSB) 1 000.0 mL
多黏菌素溶液 10.0 mL
萘啶酮酸钠溶液 10.0 mL
A.1.3.2 制法
无菌条件下,将A.1.3.1中各成分进行混合,充分混匀,分装备用。
A.2 哥伦比亚CNA血琼脂(Columbia CNA blood agar)
A.2.1 成分
胰酪蛋白胨 12.0 g
动物组织蛋白消化液 5.0 g
酵母提取物 3.0 g
牛肉提取物 3.0 g
GB 4789.11—2014
5
玉米淀粉 1.0 g
氯化钠 5.0 g
琼脂 13.5 g
多黏菌素 0.01 g
萘啶酸 0.01 g
蒸馏水 1000.0 mL
A.2.2 制法
将 A.2.1 中各成分溶于蒸馏水中,加热溶解,校正 pH 至 7.3 0.2,121 ℃灭菌 12 min,待冷却至
50 ℃左右时加 50 mL;无菌脱纤维绵羊血,摇匀后倒平板。
A.3 哥伦比亚血琼脂(Columbia blood agar)
A.3.1 基础培养基
A.3.1.1 成分
动物组织酶解物 23.0 g
淀粉 1.0 g
氯化钠 5.0 g
琼脂 8.0 g~18.0 g
蒸馏水 1 000.0 mL
A.3.1.2 制法
将基础培养基成分溶解于蒸馏水中,加热促其溶解。121 ℃高压灭菌 15 min。
A.3.2 无菌脱纤维绵羊血
无菌操作条件下,将绵羊血加入到盛有灭菌玻璃珠的容器中,振摇约 10 min,静置后除去附有血纤
维的玻璃珠即可。
A.3.3 完全培养基
A.3.3.1 组分
基础培养基 1 000.0 mL
无菌脱纤维绵羊血 50.0 mL
A.3.3.2 制法
当基础培养基的温度为 45 ℃左右时,无菌加入绵羊血,混匀。校正 pH 至 7.2±0.2。倾注 15 mL 于
无菌平皿中,静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超
过 4 h,或在 4 ℃冷藏不得超过 7 d。
A.4 革兰氏染色液
A.4.1 结晶紫染色液基础培养基
A.4.1.1 成分
GB 4789.11—2014
6
结晶紫 1.0 g
95%乙醇 20.0 mL
1%草酸铵水溶液 80.0 mL
A.4.1.2 制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
A.4.2 革兰氏碘液
A.4.2.1 成分
碘 1.0 g
碘化钾 2.0 g
蒸馏水 300.0 mL
A.4.2.2 制法
将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至 300 mL。
A.4.3 沙黄复染液
A.4.3.1 成分
沙黄 0.25 g
95%乙醇 10.0 mL
蒸馏水 90.0 mL
A.4.3.2 制法
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
A.4.4 染色操作步骤
将涂片在酒精灯火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染 1 min,水洗;滴加革兰氏碘液,作用 1 min,
水洗;滴加 95%乙醇脱色,约 15 s~30 s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗;滴加复染液,复
染 1 min,水洗后进行干燥,镜检。
A.5 胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptone soybean broth, TSB)
A.5.1 成分
胰蛋白胨 17.0 g
大豆蛋白胨 3.0 g
氯化钠 5.0 g
磷酸二氢钾(无水) 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
蒸馏水 1000.0 mL
A.5.2 制法
将A.5.1中各成分溶于蒸馏水中,加热溶解,校正pH至7.3±0.2,121 ℃灭菌15 min,分装备用。
GB 4789.11—2014
7
A.6 草酸钾血浆
A.6.1 成分
草酸钾 0.01 g
人血 5.0 mL
A.6.2 制法
草酸钾0.01 g放入灭菌小试管中,再加入5 mL人血,混匀,经离心沉淀,吸取上清液即为草酸钾血
浆。
A.7 0.25%氯化钙(CaCl 2 )溶液
A.7.1 成分
氯化钙(无水) 22.2 g
蒸馏水 1000.0 mL
A.7.2 制法
称取 22.2g 氯化钙(无水)溶于蒸馏水中,分装备用。
A.8 3%过氧化氢(H 2 O 2 )溶液
A.8.1 成分
30%过氧化氢(H 2 O 2 )溶液 100.0 mL
蒸馏水 900.0 mL
A.8.2 制法
吸取100mL 30%过氧化氢(H 2 O 2 )溶液,溶于蒸馏水中,混匀,分装备用。