- 定做培养基/定制培养基
- 颗粒培养基
- 标准菌株生化鉴定试剂盒
- 预灌装即用型成品培养基
- 2025年版中国药典
- 促销/特价商品
- 院感/疾控/体外诊断/采样管
- 样品采集与处理(均质)产品
- 按标准检索培养基
- 模拟灌装用培养基
- 干燥粉末培养基
- 培养基添加剂/补充剂
- 生化反应鉴定管
- 染色液等配套产品
- 对照培养基/标准品
- 实验耗材与器具
- 生化试剂/化学试剂
- 菌种鉴定服务
GB/T 4789
您现在的位置： 网站首页 >> GB/T 4789
GB/T 4789.30-2025 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验
[所属分类:GB/T 4789] [发布时间:2019-8-9] [发布人:wwxa] [阅读次数:] [返回]
中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
GB 4789.30—2025
食品安全国家标准
食品微生物学检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验
2025-03-16 发布 2025-09-16 实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 发 布
前 言
本标准与 GB4789.30—2016 相比, 主要变化如下:
———修改了适用范围;
———修改了培养基和试剂, 增加了 OA 李斯特氏菌显色培养基配方;
———修改了第一法 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验增菌液、 选择性培养基、 检验程序、 鉴定方
法等;
———修改了第二法 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法的样品接种、 菌落计数和确认、 结果计
数、 结果报告;
———修改了第三法 单核细胞增生李斯特氏菌 MPN 计数法的样品接种。
1
GB 4789.30—2025
食品安全国家标准
食品微生物学检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验
1 范围
本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes ) 的检验方法。
本标准第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验; 第二法适用于单核细胞增生李
斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数; 第三法适用于单核细胞增生李斯特氏菌
含量较低的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下。
2.1 冰箱:2 ℃ ~8 ℃ 。
2.2 恒温培养箱:30 ℃ ±1 ℃ 、36 ℃ ±1 ℃ 、25 ℃ ~30 ℃ 。
2.3 均质器。
2.4 显微镜:100 × ~1 000 × 。
2.5 电子天平: 感量为0.1 g、0.1 mg。
2.6 锥形瓶:100 mL、500 mL。
2.7 无菌吸管:1 mL( 具0.01 mL 刻度) 、10 mL( 具0.1 mL 刻度) 或移液器( 量程为0.1 mL、1 mL、
10 mL) 及无菌吸头。
2.8 无菌培养皿: 直径90 mm。
2.9 无菌试管:16 mm × 160 mm。
2.10 离心机:4 000 r/min。
2.11 无菌离心管:30 mm × 100 mm。
2.12 无菌注射器:1 mL。
2.13 油镜或相差显微镜。
2.14 无菌涂布棒。
2.15 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes )ATCC 19111 或 CMCC 54004 或其他等效
菌株。
2.16 英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua )ATCC33090 或其他等效菌株。
2.17 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii )ATCC19119 或其他等效菌株。
2.18 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri )ATCC35967 或其他等效菌株。
2.19 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )ATCC25923 或其他等效菌株, 要求产β-溶血环。
2.20 马红球菌(Rhodococcus equi )ATCC6939 或 NCTC1621 或其他等效菌株。
2.21 小鼠:ICR 品系, 体重18 g~22 g。
1
GB 4789.30—2025
2.22 微生物生化鉴定系统。
2.23 无菌过滤装置。
3 培养基和试剂
3.1 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE) : 见附录 A 中 A.1。
3.2 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE) : 见 A.2。
3.3 Fraser 增菌肉汤(FB1 、FB2 ) : 见 A.3。
3.4 OA 李斯特氏菌显色培养基: 见 A.4。
3.5 PALCAM 培养基: 见 A.5。
3.6 革兰氏染色液: 见 A.6。
3.7 SIM 动力培养基: 见 A.7。
3.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR) 和乙酰甲基醇(VP) 试验用]: 见 A.8。
3.9 羊血琼脂: 见 A.9。
3.10 无菌磷酸盐缓冲液: 见 A.10。
3.11 无菌生理盐水: 见 A.11。
3.12 糖发酵管: 见 A.12。
3.13 过氧化氢试剂: 见 A.13。
3.14 微生物生化鉴定试剂盒。
第一法 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验
4 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1。
2
GB 4789.30—2025
图1 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序
5 操作步骤
5.1 增菌
以无菌操作取25 g (mL) 样品, 置于盛有225 mL FB1 增菌肉汤的无菌均质杯内,8 000 r/min~
10 000 r/min 均质1 min~2 min, 或放入盛有225 mL FB1 增菌肉汤的无菌均质袋中, 用拍击式均质器
拍打1 min~2 min, 制成1∶ 10 的样品匀液。 若样品为液态, 也可采用振荡或搅拌混匀。 于30 ℃ ±1 ℃
培养24 h±2 h。 混匀, 吸取0.1 mL FB1 增菌肉汤, 转种于10 mL FB2 增菌肉汤内。 于30 ℃ ±1 ℃ 培
养24 h±2 h。
5.2 分离
取混匀后的 FB2 增菌肉汤, 分别接种于 OA 李斯特氏菌显色培养基(或其他等效李斯特氏菌显色
培养基) 平板和 PALCAM 培养基平板,36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h~48 h, 观察各个平板上生长的菌落。 典
型菌落在 OA 李斯特氏菌显色培养基平板上形成直径为1 mm~3 mm 的圆形蓝绿色菌落, 周围有不透
3
GB 4789.30—2025
明的晕圈。 典型菌落在 PALCAM 培养基平板上形成直径为1 mm~3 mm 的圆形灰绿色菌落, 周围有
棕黑色水解圈, 培养48 h 后, 部分菌落中心形成黑点且有凹陷。 其他等效李斯特氏菌显色培养基平板
上的菌落特征参照产品说明进行判定。
注1 : 一些单核细胞增生李斯特氏菌在 OA 李斯特氏菌显色培养基上的菌落周围的晕圈不明显甚至没有晕圈。 还
有一些单核细胞增生李斯特氏菌在 OA 李斯特氏菌显色培养基上的菌落周围的晕圈出现得比较迟缓, 有时
需要4d 以上才出现。
注2: 伊氏李斯特氏菌在 OA 李斯特氏菌显色培养基上的菌落形态与单核细胞增生李斯特氏菌相似。
5.3 纯培养
从每个平板(符合5.2 要求的平板) 中挑取3 个~5 个典型或可疑菌落(少于3 个全选) , 在 TSA-YE
平板或羊血平板上划线, 于36 ℃ ±1 ℃ 培养18 h~24 h。 单核细胞增生李斯特氏菌在 TSA-YE 平板或
羊血平板上, 呈灰白色, 半透明, 边缘整齐, 露滴状菌落、 直径为1 mm~2 mm。
5.4 初步鉴定
挑取 TSA-YE 平板或羊血平板上的单个菌落, 接种木糖、 鼠李糖发酵管, 于36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h±
2 h; 同时在 TSA-YE 平板或羊血平板上划线, 于36 ℃ ±1 ℃ 培养18 h~24 h, 以获取下一步鉴定用的
纯培养物。 然后选择木糖阴性, 鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。
5.5 鉴定
注: 可先从每个平板(符合5.2 要求的平板) 中挑取1 株菌进行鉴定试验, 如果鉴定为单核细胞增生李斯特氏菌, 可
直接按6 结果与报告的规定报告检出结果; 按5.3 要求挑取的3 个~5 个典型或可疑菌落(少于3 个全选) 均鉴
定为非单核细胞增生李斯特氏菌后方可报告未检出的结果。
5.5.1 镜检: 挑取18 h~24 h 纯培养的单个菌落做革兰氏染色镜检, 李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌,
大小为(0.4 μm~0.5 μm) × (0.5 μm~2.0 μm) 。 用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察,
该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
5.5.2 动力试验: 挑取18 h~24 h 纯培养的单菌落穿刺半固体或SIM 动力培养基, 于25 ℃ ~30 ℃ 培
养48 h±2 h。 李斯特氏菌沿穿刺线以不规则的云雾状向四周延伸生长, 培养基表面下3 mm~5 mm
处形成一似伞状(或梭状) 界面。 如伞状( 或梭状) 生长不明显, 可继续培养, 每天观察结果1 次, 观察
5 d。
5.5.3 生化鉴定: 挑取18 h~24 h 纯培养的单个菌落, 进行过氧化氢酶试验, 过氧化氢酶阳性反应的菌
落继续进行糖发酵试验、MR-VP 试验。 单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。
5.5.4 溶血试验: 将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20 个~25 个小格, 挑取18 h~24 h 纯培养的单个
菌落刺种到血平板上, 每格刺种1 个菌落, 并刺种阳性对照菌(单核细胞增生李斯特氏菌、 伊氏李斯特氏
菌和斯氏李斯特氏菌) 和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌) , 穿刺时尽量接近底部, 但不要触到底面, 同时
避免琼脂破裂,36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h~48 h, 于明亮处观察, 单核细胞增生李斯特氏菌呈现狭窄、 清晰、
明亮的溶血圈, 斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭窄、 微弱的溶血环, 英诺克李斯特氏菌无溶血环, 伊
氏李斯特氏菌产生宽的、 轮廓清晰的β-溶血区域。
5.5.5 协同溶血试验 CAMP(可选项目) : 在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球
菌, 挑取18 h~24 h 纯培养的单个菌落垂直划线接种于平行线之间, 垂直线两端不要触及平行线, 距离
1 mm~2 mm, 同时接种单核细胞增生李斯特氏菌、 英诺克李斯特氏菌、 伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特
氏菌, 于36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h~48 h。 单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约
2 mm 的β-溶血增强区域, 斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域, 伊氏李斯特氏菌在靠近马红球
菌处出现5 mm~10 mm 的“箭头状”β-溶血增强区域, 英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象。 若结果不
4
GB 4789.30—2025
明显, 可置2 ℃ ~8℃ 冰箱24 h~48 h 再观察。
注: 有5% ~8% 的单核细胞增生李斯特氏菌可在马红球菌一端形成轻微溶血增强(约1 mm) 现象, 此现象不属于
溶血增强的情况。
表1 单核细胞增生李斯特氏菌主要鉴定特征及与其他李斯特氏菌的区别
如选择生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统, 可不经5.4 初步鉴定, 直接从 TSA-YE 平板或羊血
平板上挑取可疑菌落, 用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液, 使用微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化
鉴定系统进行鉴定。
5.6 小鼠毒力试验(可选项目)
将符合上述特性的纯培养物接种于 TSB-YE 中, 于36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h,4000r/min 离心5 min,
弃上清液, 用无菌生理盐水制备成浓度为1010 CFU/mL 的菌悬液, 取此菌悬液对3 只~5 只小鼠进行
腹腔注射, 每只0.5 mL, 同时观察小鼠死亡情况。 小鼠于2 d~5 d 内死亡者为致病株。 试验设单核细
胞增生李斯特氏菌致病株和无菌生理盐水对照组。 单核细胞增生李斯特氏菌、 伊氏李斯特氏菌对小鼠
有致病性。
6 结果与报告
综合5.4、5.5 鉴定结果, 报告25 g(mL) 样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。 25 g(mL)
样品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌也可报告为0/25 g(mL) 。
5
GB 4789.30—2025
第二法 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法
7 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序见图2。
图2 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序
8 操作步骤
8.1 样品的稀释
8.1 .1 以无菌操作取25 g(mL) 样品, 置于盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或无添加剂的Fraser 增菌肉汤的
无菌均质杯内,8 000r/min~10 000r/min 均质1 min~2 min, 或放入盛有225 mL 上述稀释液的无菌
均质袋中, 用拍击式均质器拍打1 min~2 min, 制成1∶ 10 的样品匀液。 若样品为液态, 也可采用振荡
或搅拌混匀, 制成1∶ 10 的样品匀液。
8.1 .2 用1 mL 无菌吸管或移液器吸取1∶ 10 样品匀液1 mL, 沿管壁缓慢注于盛有9 mL 磷酸盐缓冲
液或无添加剂的 Fraser 增菌肉汤的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面) , 充分混匀,
制成1∶ 100 的样品匀液。
8.1 .3 按8.1.2 操作程序, 制备10 倍系列稀释样品匀液。 每递增稀释1 次, 换用1 支1 mL 无菌吸管或
吸头。
6
GB 4789.30—2025
8.2 样品的接种
8.2.1 根据对样品污染状况的估计, 选择2 个~3 个适宜连续稀释度的样品匀液( 液体样品可包括原
液) , 每个稀释度分别吸取0.1mL 样品匀液, 接种1 个 OA 李斯特氏菌显色培养基( 或其他等效的李斯
特氏菌显色培养基) 平板。 并用无菌涂布棒涂布整个平板, 注意不要触及平板边缘。 使用前, 如琼脂平
板表面有水珠, 可放在25 ℃ ~50 ℃ 的培养箱里干燥, 直到平板表面的水珠消失。
注: 必要时, 每个稀释度可做重复试验。
8.2.2 对 于 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 氏 菌 含 量 较 低 的 食 品 样 品, 吸 取 1mL 最 低 稀 释 度 样 品 匀 液, 以
0.3 mL、 0.3 mL、0.4 mL 的接种量分别涂布于3 块 OA 李斯特氏菌显色培养基(或其他等效的李斯特
氏菌显色培养基) 平板。 涂布方法同8.2.1。
8.2.3 从样品稀释至样品接种完毕不得超过45 min。
8.3 培养
8.3.1 通常情况下, 涂布后, 将平板正置于水平桌上10 min~20 min 后翻转平皿, 放入培养箱培养,
36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h~48 h。
8.3.2 如果样液不易吸收, 可将平板正置在培养箱36 ℃ ±1 ℃ 培养1 h, 等样品匀液吸收后再翻转平
皿, 倒置于培养箱,36 ℃ ±1 ℃ 继续培养24 h~48 h。
8.4 典型菌落计数和确认
8.4.1 选择有典型或可疑单核细胞增生李斯特氏菌菌落生长的平板, 如果:
b) 所有稀释度的平板合计典型或可疑菌落数均小于15 CFU, 应计数最低稀释度平板上的典型或
可疑菌落数;
d) 所有稀释度的合计平板典型或可疑菌落数均不在15 CFU~150 CFU 之间, 其中一部分小于
15 CFU 或大于150 CFU 时, 应计数最接近15 CFU 或150 CFU 的稀释度平板上的典型或可
疑菌落数;
符合a) ~d) 者按9.1.1 中式(1) 计算。
8.4.2 从每个平板(符合5.2 要求的平板) 中挑取5 个典型或可疑菌落(少于5 个全选) , 按照5.3、5.4、
5.5 进行鉴定。
9 结果与报告
9.1 计数方法
9.1 .1 式(1) :
7
GB 4789.30—2025
T = AB
CVd … … … … … … … … … …( 1 )
式中:
T ———样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数[ CFU/g(mL) ];
A ———计数稀释度典型或可疑菌落的总数;
B ———计数稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;
C ———计数稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;
V ———计数稀释度的接种量, 以毫升(mL) 计;
d ———稀释因子。
9.1 .2 式(2) :
T =A1B1/C1 +A2B2/C2
Vd … … … … … … … … … …( 2 )
式中:
T ———样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数[ CFU/g(mL) ];
A1 ———第一计数稀释度(低稀释倍数) 单核细胞增生李斯特氏菌典型或可疑菌落的总数;
A2 ———第二计数稀释度(高稀释倍数) 单核细胞增生李斯特氏菌典型或可疑菌落的总数;
B1 ———第一计数稀释度(低稀释倍数) 鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;
B2 ———第二计数稀释度(高稀释倍数) 鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;
C1 ———第一计数稀释度(低稀释倍数) 用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数;
C2 ———第二计数稀释度(高稀释倍数) 用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数;
V ———第一计数稀释度接种量加第二计数稀释度1/10 接种量, 以毫升(mL) 计, 如: 接种量采用
0.1 mL 方法的V 值为0.11; 接种量采用0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 方法的V 值为1.1;
d ———稀释因子(第一个稀释度) 。
9.2 结果报告
9.2.1 菌落数小于100 CFU 时, 按“四舍五入”原则修约, 以整数报告。
9.2.2 菌落数大于或等于100 CFU 时, 第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后, 取前两位数字, 后面用
0 代替位数。 也可用10 的指数形式来表示, 按“四舍五入”原则修约后, 保留两位有效数字。
9.2.3 报告每g(mL) 样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数, 以 CFU/g(mL) 表示; 如T 值为0, 接种
量采用0.1 mL 方法的以小于10 乘以最低稀释倍数报告。 接种量采用0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 方法的
以小于1 乘以最低稀释倍数报告。
第三法 单核细胞增生李斯特氏菌 MPN 计数法
10 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌 MPN 计数法检验程序见图3。
8
GB 4789.30—2025
图3 单核细胞增生李斯特氏菌 MPN 计数法检验程序
11 操作步骤
11 .1 样品的稀释
样品稀释液用磷酸盐缓冲液。 样品稀释方法同8.1。
11 .2 接种和培养
11 .2.1 根据对样品污染状况的估计, 选取3 个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液) , 接
种于10 mL FB1 增菌肉汤, 每一稀释度接种3 管, 每管接种1 mL。 如果接种量为10 mL, 接种至10 mL
双料 FB1 增菌肉汤。 于30 ℃ ±1 ℃ 培养24 h±2 h。 每管各吸取0.1 mL, 转种于10 mL FB2 增菌肉汤
内, 于30 ℃ ±1 ℃ 培养24 h±2 h。
11 .2.2 用接种环分别从 FB2 增菌肉汤各管中移取1 环, 接种 OA 李斯特氏菌显色培养基(或其他等效
的李斯特氏菌显色培养基) 平板,36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h~48 h。
11 .3 确证试验
从每个平板(符合5.2 要求的平板) 中挑取3 个~5 个典型或可疑菌落(少于3 个全选) , 按照5.3、
5.4、 5.5 进行鉴定。
12 结果与报告
根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌阳性的试管管数, 查 MPN 检索表( 见附录 B) , 报告每克( 毫
升) 样品中单核细胞增生李斯特氏菌的最可能数, 以 MPN/g(mL) 表示。
9
GB 4789.30—2025
附 录 A
培养基和试剂
A.1 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)
A.1 .1 成分
将上述各成分加热搅拌溶解, 必要时调节pH, 分装,121 ℃ 高压灭菌15 min, 备用。 培养基灭菌后
25 ℃ 的pH 为7.2±0.2。
A.2 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)
A.2.1 成分
将上述各成分加热搅拌溶解, 必要时调节 pH 至7.2 ±0.2, 分装,121 ℃ 高压灭菌15 min, 冷却至
47 ℃ ~50 ℃ , 倾倒在无菌的平皿中, 备用。 培养基灭菌后25 ℃ 的pH 为7.2±0.2。
A.3 Fraser 增菌肉汤(FB1 、FB2 )
A.3.1 基础培养基
A.3.1 .1 成分
10
GB 4789.30—2025
将上述各成分加热搅拌溶解, 必要时调节pH, 分装,121 ℃ 高压灭菌15 min, 冷却至47 ℃ ~50 ℃ 。
培养基灭菌后25 ℃ 的pH 为7.2±0.2。
A.3.2 添加剂
A.3.2.1 1 %萘啶酮酸溶液
将0.5 g 萘啶酮酸钠盐溶于50 mL0.05 mol/L 氢氧化钠中, 并通过0.45 μm 无菌滤膜过滤除菌。
A.3.2.2 0.25%盐酸吖啶黄溶液
将0.25 g 盐酸吖啶黄溶于100 mL 蒸馏水中, 用0.45 μm 的无菌滤膜过滤除菌。
A.3.2.3 5%柠檬酸铁铵溶液
将5 g 柠檬酸铁铵溶于100 mL 蒸馏水中, 用0.45 μm 的无菌滤膜过滤除菌。
A.3.3 完全培养基
A.3.3.1 FB1 增菌肉汤
11
GB 4789.30—2025
A.4.1 .2 制法
将上述各成分加热搅拌溶解, 必要时调节pH, 分装,121 ℃ 高压灭菌15 min, 冷却至47 ℃ ~50 ℃ 。
培养基灭菌后25 ℃ 的pH 为7.2±0.2。
A.4.2 添加剂
A.4.2.1 0.4%萘啶酮酸溶液
将0.02 g 萘啶酮酸钠盐溶于5 mL 氢氧化钠中, 并通过0.45 μm 无菌滤膜过滤除菌。
A.4.2.2 0.4%头孢他啶溶液
将0.02 g 头孢他啶溶于5 mL 蒸馏水中, 用0.45 μm 的无菌滤膜过滤除菌。
A.4.2.3 多黏菌素 B 溶液
将76 700IU 硫酸多黏菌素 B 溶于5 mL 蒸馏水中, 用0.45 μm 的无菌滤膜过滤除菌。
A.4.2.4 2%环己酰亚胺溶液
将0.05 g 环己酰亚胺溶于2.5 mL 无水乙醇中, 然后加蒸馏水 2.5 mL, 用0.45μm 的无菌滤膜过滤
除菌。
A.4.2.5 0.1 %两性霉素 B 溶液(作为环己酰亚胺溶液的替代品)
将2.5 mL 盐酸(1 mol/L) 和7.5 mL 二甲基甲酰胺(DMF) 混合成 HCl/DMF 溶液, 加0.01 g 两性
霉素溶解后, 用0.45 μm 的无菌滤膜过滤除菌。
A.4.2.6 L-α-磷脂酰肌醇溶液
将2 g 的L-α-磷脂酰肌醇溶于50 mL 的蒸馏水中(可以使用2 g 含有9%~15%的未分级磷脂酰肌
醇的大豆卵磷脂代替 L-α-磷脂酰肌醇) , 搅拌约30 min 直至获得均匀的悬浮液。 在121 ℃ 下高压灭菌
15 min, 然后冷却至47 ℃ ~50 ℃ 。
A.4.3 完全培养基
A.4.3.1 成分
12
GB 4789.30—2025
在基础培养基(A.4.1) 冷却至47 ℃ ~50 ℃ 时, 依次加入萘啶酮酸、 头孢他啶、 多黏菌素B、 环己酰亚
胺或两性霉素 B、L-α-磷脂酰肌醇溶液。 每次添加均需要立即充分混合均匀。 完全培养基的 pH 在
25 ℃ 下应为7.2±0.2, 介质应均匀呈轻微乳白色。 混匀后倾倒在无菌的平皿中, 每个培养皿中倒入
18 mL~20 mL, 凝固后备用。
A.5 PALCAM 培养基
A.5.1 成分
将上述各成分加热搅拌溶解, 必要时调节pH, 分装,121 ℃ 高压灭菌15 min。 培养基灭菌后25 ℃
的pH 为7.2±0.2。
A.5.2.1 PALCAM 选择性添加剂
将PALCAM 基础培养基冷却至47 ℃ ~50 ℃ , 加入2 mL PALCAM 选择性添加剂, 混匀后倾倒在
无菌的平皿中, 每个培养皿中倒入18 mL~20 mL, 凝固后备用。
13
GB 4789.30—2025
A.6 革兰氏染色液
A.6.1 结晶紫染色液
A.6.1 .1 成分
将结晶紫完全溶解于乙醇中, 然后与草酸铵水溶液混合。
A.6.2 革兰氏碘液
A.6.2.1 成分
将碘与碘化钾先进行混合, 加入少许蒸馏水, 充分振摇, 待完全溶解后, 再加蒸馏水至300 mL。
A.6.3 沙黄复染液
A.6.3.1 成分
A.6.4.1 涂片用火焰固定后滴加结晶紫染液, 作用1 min, 水洗。
A.6.4.2 滴加革兰氏碘液, 作用1 min, 水洗。
A.6.4.3 滴加95%乙醇脱色15 s~30 s, 直至染色液被洗掉, 不要过分脱色, 水洗。
A.6.4.4 滴加复染液, 复染 1 min, 水洗、 待干、 镜检。
A.7 SIM 动力培养基
A.7.1 成分
14
GB 4789.30—2025
将上述各成分加热搅拌溶解, 必要时调节pH, 分装小试管,121 ℃ 高压灭菌15 min, 备用。 培养基
灭菌后25 ℃ 的pH 为7.2±0.2。
A.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR) 和乙酰甲基醇(VP) 试验用]
A.8.1 成分
将上述各成分加热搅拌溶解, 必要时调节pH, 分装试管, 每管1 mL。 121 ℃ 高压灭菌15 min, 备
用。 缓冲葡萄糖蛋白胨水灭菌后25 ℃ 的pH 为7.2±0.2。
A.8.3 甲基红(MR) 试验
A.8.3.1 甲基红试剂
A.8.3.1 .1 成分
10 mg 甲基红溶于30 mL95%乙醇中, 然后加入20 mL 蒸馏水。
A.8.3.1 .3 试验方法
取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中,36 ℃ ±1 ℃ 培养2 d~5 d。 滴加甲基红试剂
1 滴, 立即观察结果。 鲜红色为阳性, 黄色为阴性。
A.8.4 乙酰甲基甲醇(VP) 试验
A.8.4.1 6%α-萘酚-乙醇溶液
成分及制法: 取α-萘酚6.0 g, 加无水乙醇溶解, 定容至100 mL。
A.8.4.2 40%氢氧化钾溶液
成分及制法: 取氢氧化钾40 g, 加蒸馏水溶解, 定容至100 mL。
15
GB 4789.30—2025
A.8.4.3 试验方法
取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中,36 ℃ ±1 ℃ 培养2 d~4 d, 加入6% α-萘酚-乙醇
溶液0.5 mL 和40%氢氧化钾溶液0.2 mL, 充分振摇试管, 观察结果。 阳性反应立刻或于数分钟内出现
红色, 如为阴性, 应放在36 ℃ ±1 ℃ 继续培养1 h 再进行观察。
A.9 羊血琼脂
A.9.1 成分
除新鲜脱纤维羊血外, 加热溶化上述各组分,121 ℃ 高压灭菌15 min, 冷至50 ℃ , 以无菌操作加入
新鲜脱纤维羊血, 摇匀, 倾注平板。
A.10 无菌磷酸盐缓冲液
A.10.1 储存液成分
A.10.2.1 1 mol/L 氢氧化钠: 称取20.0 g 的氢氧化钠溶于500 mL 蒸馏水中。
A.10.2.2 储存液: 称取34.0 g 的磷酸二氢钾溶于500 mL 蒸馏水中, 用大约175 mL 的1 mol/L 氢氧
化钠溶液调节pH 至7.2, 用蒸馏水定容至1 000 mL 后储存于冰箱。
A.10.2.3 工作液: 取储存液1.25 mL, 用蒸馏水稀释至1 000 mL, 分装于适宜容器中,121 ℃ 高压灭菌
15 min。
A.11 无菌生理盐水
A.11 .1 成分
称取8.5g 的氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中, 分装于适宜容器中,121 ℃ 高压灭菌15 min。
16
GB 4789.30—2025
A.12 糖发酵管
A.12.1 糖发酵基础肉汤
A.12.2.1 将上述各成分加热搅拌溶解, 必要时调节pH, 分装每瓶100 mL,121 ℃ 高压灭菌15 min, 备
用。 糖发酵基础肉汤灭菌后25 ℃ 的pH 为7.4±0.2。
A.12.2.2 葡萄糖发酵管: 用蒸馏水将葡萄糖配制成10% 溶液,121 ℃ 高压灭菌15 min。 无菌吸取5
mL 葡萄糖溶液加入按 A.12.2.1 配制的100 mL 糖发酵基础肉汤内, 混匀后, 以无菌操作分装于小试管
中, 备用。 葡萄糖发酵管25 ℃ 的pH 为7.4±0.2。
A.12.2.3 其他各种糖发酵管: 可按照 A.12.2.2 葡萄糖发酵管的配制方法制备其他糖类发酵管。
A.12.3 试验方法
取适量纯培养物接种于糖发酵管,36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h~48 h, 观察结果, 蓝色为阴性, 黄色为
阳性。
A.13 过氧化氢试剂
A.13.1 试剂
3%过氧化氢溶液, 临用配制。
A.13.2 过氧化氢酶试验方法
用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落, 置于洁净玻璃平皿内, 滴加3% 过氧化氢溶液2 滴, 观
察结果。
A.13.3 结果
于0.5 min 内发生气泡者为阳性, 不发生气泡者为阴性。
17
GB 4789.30—2025
附 录 B
单核细胞增生李斯特氏菌最可能数(MPN) 表
每克(毫升) 检样中单核细胞增生李斯特氏菌最可能数(MPN) 的检索见表 B.1。
表 B.1 单核细胞增生李斯特氏菌最可能数(MPN) 检索表
GB 4789.30—2025
食品安全国家标准
食品微生物学检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验
2025-03-16 发布 2025-09-16 实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 发 布
前 言
|
本标准代替 GB4789.30—2016《 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌检验》。 |
单核细胞增生李斯特氏 |
———修改了适用范围;
———修改了培养基和试剂, 增加了 OA 李斯特氏菌显色培养基配方;
———修改了第一法 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验增菌液、 选择性培养基、 检验程序、 鉴定方
法等;
———修改了第二法 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法的样品接种、 菌落计数和确认、 结果计
数、 结果报告;
———修改了第三法 单核细胞增生李斯特氏菌 MPN 计数法的样品接种。
1
GB 4789.30—2025
食品安全国家标准
食品微生物学检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验
1 范围
本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes ) 的检验方法。
本标准第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验; 第二法适用于单核细胞增生李
斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数; 第三法适用于单核细胞增生李斯特氏菌
含量较低的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下。
2.1 冰箱:2 ℃ ~8 ℃ 。
2.2 恒温培养箱:30 ℃ ±1 ℃ 、36 ℃ ±1 ℃ 、25 ℃ ~30 ℃ 。
2.3 均质器。
2.4 显微镜:100 × ~1 000 × 。
2.5 电子天平: 感量为0.1 g、0.1 mg。
2.6 锥形瓶:100 mL、500 mL。
2.7 无菌吸管:1 mL( 具0.01 mL 刻度) 、10 mL( 具0.1 mL 刻度) 或移液器( 量程为0.1 mL、1 mL、
10 mL) 及无菌吸头。
2.8 无菌培养皿: 直径90 mm。
2.9 无菌试管:16 mm × 160 mm。
2.10 离心机:4 000 r/min。
2.11 无菌离心管:30 mm × 100 mm。
2.12 无菌注射器:1 mL。
2.13 油镜或相差显微镜。
2.14 无菌涂布棒。
2.15 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes )ATCC 19111 或 CMCC 54004 或其他等效
菌株。
2.16 英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua )ATCC33090 或其他等效菌株。
2.17 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii )ATCC19119 或其他等效菌株。
2.18 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri )ATCC35967 或其他等效菌株。
2.19 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )ATCC25923 或其他等效菌株, 要求产β-溶血环。
2.20 马红球菌(Rhodococcus equi )ATCC6939 或 NCTC1621 或其他等效菌株。
2.21 小鼠:ICR 品系, 体重18 g~22 g。
1
GB 4789.30—2025
2.22 微生物生化鉴定系统。
2.23 无菌过滤装置。
3 培养基和试剂
3.1 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE) : 见附录 A 中 A.1。
3.2 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE) : 见 A.2。
3.3 Fraser 增菌肉汤(FB1 、FB2 ) : 见 A.3。
3.4 OA 李斯特氏菌显色培养基: 见 A.4。
3.5 PALCAM 培养基: 见 A.5。
3.6 革兰氏染色液: 见 A.6。
3.7 SIM 动力培养基: 见 A.7。
3.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR) 和乙酰甲基醇(VP) 试验用]: 见 A.8。
3.9 羊血琼脂: 见 A.9。
3.10 无菌磷酸盐缓冲液: 见 A.10。
3.11 无菌生理盐水: 见 A.11。
3.12 糖发酵管: 见 A.12。
3.13 过氧化氢试剂: 见 A.13。
3.14 微生物生化鉴定试剂盒。
第一法 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验
4 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1。
2
GB 4789.30—2025
图1 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序
5 操作步骤
5.1 增菌
以无菌操作取25 g (mL) 样品, 置于盛有225 mL FB1 增菌肉汤的无菌均质杯内,8 000 r/min~
10 000 r/min 均质1 min~2 min, 或放入盛有225 mL FB1 增菌肉汤的无菌均质袋中, 用拍击式均质器
拍打1 min~2 min, 制成1∶ 10 的样品匀液。 若样品为液态, 也可采用振荡或搅拌混匀。 于30 ℃ ±1 ℃
培养24 h±2 h。 混匀, 吸取0.1 mL FB1 增菌肉汤, 转种于10 mL FB2 增菌肉汤内。 于30 ℃ ±1 ℃ 培
养24 h±2 h。
5.2 分离
取混匀后的 FB2 增菌肉汤, 分别接种于 OA 李斯特氏菌显色培养基(或其他等效李斯特氏菌显色
培养基) 平板和 PALCAM 培养基平板,36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h~48 h, 观察各个平板上生长的菌落。 典
型菌落在 OA 李斯特氏菌显色培养基平板上形成直径为1 mm~3 mm 的圆形蓝绿色菌落, 周围有不透
3
GB 4789.30—2025
明的晕圈。 典型菌落在 PALCAM 培养基平板上形成直径为1 mm~3 mm 的圆形灰绿色菌落, 周围有
棕黑色水解圈, 培养48 h 后, 部分菌落中心形成黑点且有凹陷。 其他等效李斯特氏菌显色培养基平板
上的菌落特征参照产品说明进行判定。
注1 : 一些单核细胞增生李斯特氏菌在 OA 李斯特氏菌显色培养基上的菌落周围的晕圈不明显甚至没有晕圈。 还
有一些单核细胞增生李斯特氏菌在 OA 李斯特氏菌显色培养基上的菌落周围的晕圈出现得比较迟缓, 有时
需要4d 以上才出现。
注2: 伊氏李斯特氏菌在 OA 李斯特氏菌显色培养基上的菌落形态与单核细胞增生李斯特氏菌相似。
5.3 纯培养
从每个平板(符合5.2 要求的平板) 中挑取3 个~5 个典型或可疑菌落(少于3 个全选) , 在 TSA-YE
平板或羊血平板上划线, 于36 ℃ ±1 ℃ 培养18 h~24 h。 单核细胞增生李斯特氏菌在 TSA-YE 平板或
羊血平板上, 呈灰白色, 半透明, 边缘整齐, 露滴状菌落、 直径为1 mm~2 mm。
5.4 初步鉴定
挑取 TSA-YE 平板或羊血平板上的单个菌落, 接种木糖、 鼠李糖发酵管, 于36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h±
2 h; 同时在 TSA-YE 平板或羊血平板上划线, 于36 ℃ ±1 ℃ 培养18 h~24 h, 以获取下一步鉴定用的
纯培养物。 然后选择木糖阴性, 鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。
5.5 鉴定
注: 可先从每个平板(符合5.2 要求的平板) 中挑取1 株菌进行鉴定试验, 如果鉴定为单核细胞增生李斯特氏菌, 可
直接按6 结果与报告的规定报告检出结果; 按5.3 要求挑取的3 个~5 个典型或可疑菌落(少于3 个全选) 均鉴
定为非单核细胞增生李斯特氏菌后方可报告未检出的结果。
5.5.1 镜检: 挑取18 h~24 h 纯培养的单个菌落做革兰氏染色镜检, 李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌,
大小为(0.4 μm~0.5 μm) × (0.5 μm~2.0 μm) 。 用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察,
该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
5.5.2 动力试验: 挑取18 h~24 h 纯培养的单菌落穿刺半固体或SIM 动力培养基, 于25 ℃ ~30 ℃ 培
养48 h±2 h。 李斯特氏菌沿穿刺线以不规则的云雾状向四周延伸生长, 培养基表面下3 mm~5 mm
处形成一似伞状(或梭状) 界面。 如伞状( 或梭状) 生长不明显, 可继续培养, 每天观察结果1 次, 观察
5 d。
5.5.3 生化鉴定: 挑取18 h~24 h 纯培养的单个菌落, 进行过氧化氢酶试验, 过氧化氢酶阳性反应的菌
落继续进行糖发酵试验、MR-VP 试验。 单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。
5.5.4 溶血试验: 将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20 个~25 个小格, 挑取18 h~24 h 纯培养的单个
菌落刺种到血平板上, 每格刺种1 个菌落, 并刺种阳性对照菌(单核细胞增生李斯特氏菌、 伊氏李斯特氏
菌和斯氏李斯特氏菌) 和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌) , 穿刺时尽量接近底部, 但不要触到底面, 同时
避免琼脂破裂,36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h~48 h, 于明亮处观察, 单核细胞增生李斯特氏菌呈现狭窄、 清晰、
明亮的溶血圈, 斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭窄、 微弱的溶血环, 英诺克李斯特氏菌无溶血环, 伊
氏李斯特氏菌产生宽的、 轮廓清晰的β-溶血区域。
5.5.5 协同溶血试验 CAMP(可选项目) : 在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球
菌, 挑取18 h~24 h 纯培养的单个菌落垂直划线接种于平行线之间, 垂直线两端不要触及平行线, 距离
1 mm~2 mm, 同时接种单核细胞增生李斯特氏菌、 英诺克李斯特氏菌、 伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特
氏菌, 于36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h~48 h。 单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约
2 mm 的β-溶血增强区域, 斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域, 伊氏李斯特氏菌在靠近马红球
菌处出现5 mm~10 mm 的“箭头状”β-溶血增强区域, 英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象。 若结果不
4
GB 4789.30—2025
明显, 可置2 ℃ ~8℃ 冰箱24 h~48 h 再观察。
注: 有5% ~8% 的单核细胞增生李斯特氏菌可在马红球菌一端形成轻微溶血增强(约1 mm) 现象, 此现象不属于
溶血增强的情况。
表1 单核细胞增生李斯特氏菌主要鉴定特征及与其他李斯特氏菌的区别
| 菌种 | 木糖 | 鼠李糖 | 葡萄糖 | 麦芽糖 | 甘露醇 | 七叶苷 | MR-VP | 溶血试验 |
|
单核细胞增生李斯特氏菌 (L .monocytogenes ) |
- | + | + | + | - | + | +/+ | + |
|
格氏李斯特氏菌 (L .grayi ) |
- | - | + | + | + | + | +/+ | - |
|
斯氏李斯特氏菌 (L s. eeligeri ) |
+ | - | + | + | - | + | +/+ | + |
|
威氏李斯特氏菌 (L .welshimeri ) |
+ | V | + | + | - | + | +/+ | - |
|
伊氏李斯特氏菌 (L i. vanovii ) |
+ | - | + | + | - | + | +/+ | + |
|
英诺克李斯特氏菌 (L i. nnocua ) |
- | V | + | + | - | + | +/+ | - |
| 部分单核细胞增生李斯特氏菌不溶血。 个别单核细胞增生李斯特氏菌血清型不能发酵鼠李糖 | ||||||||
|
注: - 表示90% ~100% 的菌株阴性; + 表示90% ~100% 的菌株阳性; V 表示反应不定。 |
平板上挑取可疑菌落, 用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液, 使用微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化
鉴定系统进行鉴定。
5.6 小鼠毒力试验(可选项目)
将符合上述特性的纯培养物接种于 TSB-YE 中, 于36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h,4000r/min 离心5 min,
弃上清液, 用无菌生理盐水制备成浓度为1010 CFU/mL 的菌悬液, 取此菌悬液对3 只~5 只小鼠进行
腹腔注射, 每只0.5 mL, 同时观察小鼠死亡情况。 小鼠于2 d~5 d 内死亡者为致病株。 试验设单核细
胞增生李斯特氏菌致病株和无菌生理盐水对照组。 单核细胞增生李斯特氏菌、 伊氏李斯特氏菌对小鼠
有致病性。
6 结果与报告
综合5.4、5.5 鉴定结果, 报告25 g(mL) 样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。 25 g(mL)
样品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌也可报告为0/25 g(mL) 。
5
GB 4789.30—2025
第二法 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法
7 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序见图2。
图2 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序
8 操作步骤
8.1 样品的稀释
8.1 .1 以无菌操作取25 g(mL) 样品, 置于盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或无添加剂的Fraser 增菌肉汤的
无菌均质杯内,8 000r/min~10 000r/min 均质1 min~2 min, 或放入盛有225 mL 上述稀释液的无菌
均质袋中, 用拍击式均质器拍打1 min~2 min, 制成1∶ 10 的样品匀液。 若样品为液态, 也可采用振荡
或搅拌混匀, 制成1∶ 10 的样品匀液。
8.1 .2 用1 mL 无菌吸管或移液器吸取1∶ 10 样品匀液1 mL, 沿管壁缓慢注于盛有9 mL 磷酸盐缓冲
液或无添加剂的 Fraser 增菌肉汤的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面) , 充分混匀,
制成1∶ 100 的样品匀液。
8.1 .3 按8.1.2 操作程序, 制备10 倍系列稀释样品匀液。 每递增稀释1 次, 换用1 支1 mL 无菌吸管或
吸头。
6
GB 4789.30—2025
8.2 样品的接种
8.2.1 根据对样品污染状况的估计, 选择2 个~3 个适宜连续稀释度的样品匀液( 液体样品可包括原
液) , 每个稀释度分别吸取0.1mL 样品匀液, 接种1 个 OA 李斯特氏菌显色培养基( 或其他等效的李斯
特氏菌显色培养基) 平板。 并用无菌涂布棒涂布整个平板, 注意不要触及平板边缘。 使用前, 如琼脂平
板表面有水珠, 可放在25 ℃ ~50 ℃ 的培养箱里干燥, 直到平板表面的水珠消失。
注: 必要时, 每个稀释度可做重复试验。
8.2.2 对 于 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 氏 菌 含 量 较 低 的 食 品 样 品, 吸 取 1mL 最 低 稀 释 度 样 品 匀 液, 以
0.3 mL、 0.3 mL、0.4 mL 的接种量分别涂布于3 块 OA 李斯特氏菌显色培养基(或其他等效的李斯特
氏菌显色培养基) 平板。 涂布方法同8.2.1。
8.2.3 从样品稀释至样品接种完毕不得超过45 min。
8.3 培养
8.3.1 通常情况下, 涂布后, 将平板正置于水平桌上10 min~20 min 后翻转平皿, 放入培养箱培养,
36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h~48 h。
8.3.2 如果样液不易吸收, 可将平板正置在培养箱36 ℃ ±1 ℃ 培养1 h, 等样品匀液吸收后再翻转平
皿, 倒置于培养箱,36 ℃ ±1 ℃ 继续培养24 h~48 h。
8.4 典型菌落计数和确认
8.4.1 选择有典型或可疑单核细胞增生李斯特氏菌菌落生长的平板, 如果:
| a) |
只有1 个稀释度的平板合计典型或可疑菌落数在15 CFU~150 CFU 之间, 应计数该稀释度 平板上的典型或可疑菌落数; |
可疑菌落数;
| c) |
所有稀释度的平板合计典型或可疑菌落数大于 150 CFU, 应计数最高稀释度平板上的典型或 可疑菌落数; |
15 CFU 或大于150 CFU 时, 应计数最接近15 CFU 或150 CFU 的稀释度平板上的典型或可
疑菌落数;
符合a) ~d) 者按9.1.1 中式(1) 计算。
| e) |
2 个连续稀释度的合计平板典型或可疑菌落数均在15 CFU~150 CFU 之间, 按9.1.2 中式(2) 计算。 |
5.5 进行鉴定。
9 结果与报告
9.1 计数方法
9.1 .1 式(1) :
7
GB 4789.30—2025
T = AB
CVd … … … … … … … … … …( 1 )
式中:
T ———样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数[ CFU/g(mL) ];
A ———计数稀释度典型或可疑菌落的总数;
B ———计数稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;
C ———计数稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;
V ———计数稀释度的接种量, 以毫升(mL) 计;
d ———稀释因子。
9.1 .2 式(2) :
T =A1B1/C1 +A2B2/C2
Vd … … … … … … … … … …( 2 )
式中:
T ———样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数[ CFU/g(mL) ];
A1 ———第一计数稀释度(低稀释倍数) 单核细胞增生李斯特氏菌典型或可疑菌落的总数;
A2 ———第二计数稀释度(高稀释倍数) 单核细胞增生李斯特氏菌典型或可疑菌落的总数;
B1 ———第一计数稀释度(低稀释倍数) 鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;
B2 ———第二计数稀释度(高稀释倍数) 鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;
C1 ———第一计数稀释度(低稀释倍数) 用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数;
C2 ———第二计数稀释度(高稀释倍数) 用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数;
V ———第一计数稀释度接种量加第二计数稀释度1/10 接种量, 以毫升(mL) 计, 如: 接种量采用
0.1 mL 方法的V 值为0.11; 接种量采用0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 方法的V 值为1.1;
d ———稀释因子(第一个稀释度) 。
9.2 结果报告
9.2.1 菌落数小于100 CFU 时, 按“四舍五入”原则修约, 以整数报告。
9.2.2 菌落数大于或等于100 CFU 时, 第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后, 取前两位数字, 后面用
0 代替位数。 也可用10 的指数形式来表示, 按“四舍五入”原则修约后, 保留两位有效数字。
9.2.3 报告每g(mL) 样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数, 以 CFU/g(mL) 表示; 如T 值为0, 接种
量采用0.1 mL 方法的以小于10 乘以最低稀释倍数报告。 接种量采用0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 方法的
以小于1 乘以最低稀释倍数报告。
第三法 单核细胞增生李斯特氏菌 MPN 计数法
10 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌 MPN 计数法检验程序见图3。
8
GB 4789.30—2025
图3 单核细胞增生李斯特氏菌 MPN 计数法检验程序
11 操作步骤
11 .1 样品的稀释
样品稀释液用磷酸盐缓冲液。 样品稀释方法同8.1。
11 .2 接种和培养
11 .2.1 根据对样品污染状况的估计, 选取3 个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液) , 接
种于10 mL FB1 增菌肉汤, 每一稀释度接种3 管, 每管接种1 mL。 如果接种量为10 mL, 接种至10 mL
双料 FB1 增菌肉汤。 于30 ℃ ±1 ℃ 培养24 h±2 h。 每管各吸取0.1 mL, 转种于10 mL FB2 增菌肉汤
内, 于30 ℃ ±1 ℃ 培养24 h±2 h。
11 .2.2 用接种环分别从 FB2 增菌肉汤各管中移取1 环, 接种 OA 李斯特氏菌显色培养基(或其他等效
的李斯特氏菌显色培养基) 平板,36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h~48 h。
11 .3 确证试验
从每个平板(符合5.2 要求的平板) 中挑取3 个~5 个典型或可疑菌落(少于3 个全选) , 按照5.3、
5.4、 5.5 进行鉴定。
12 结果与报告
根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌阳性的试管管数, 查 MPN 检索表( 见附录 B) , 报告每克( 毫
升) 样品中单核细胞增生李斯特氏菌的最可能数, 以 MPN/g(mL) 表示。
9
GB 4789.30—2025
附 录 A
培养基和试剂
A.1 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)
A.1 .1 成分
|
胰蛋白胨(胰酪胨) 多价胨 酵母膏粉 氯化钠 磷酸氢二钾 葡萄糖 蒸馏水 A.1 .2 制法 |
17.0 g 3.0 g 6.0 g 5.0 g 2.5 g 2.5 g 1 000 mL |
25 ℃ 的pH 为7.2±0.2。
A.2 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)
A.2.1 成分
|
胰蛋白胨(胰酪胨) 多价胨 酵母膏粉 氯化钠 磷酸氢二钾 葡萄糖 琼脂 蒸馏水 A.2.2 制法 |
17.0 g 3.0 g 6.0 g 5.0 g 2.5 g 2.5 g 15.0 g 1 000 mL |
47 ℃ ~50 ℃ , 倾倒在无菌的平皿中, 备用。 培养基灭菌后25 ℃ 的pH 为7.2±0.2。
A.3 Fraser 增菌肉汤(FB1 、FB2 )
A.3.1 基础培养基
A.3.1 .1 成分
|
胰蛋白胨(胰酪胨) 牛肉膏粉 酵母膏粉 蛋白胨 |
5.0 g 5.0 g 5.0 g 5.0 g |
GB 4789.30—2025
|
氯化钠 磷酸二氢钾 磷酸氢二钠 氯化锂 七叶苷 蒸馏水 A.3.1 .2 制法 |
20.0 g 1.35 g 12.0 g 3.0 g 1.0 g 1 000 mL |
培养基灭菌后25 ℃ 的pH 为7.2±0.2。
A.3.2 添加剂
A.3.2.1 1 %萘啶酮酸溶液
将0.5 g 萘啶酮酸钠盐溶于50 mL0.05 mol/L 氢氧化钠中, 并通过0.45 μm 无菌滤膜过滤除菌。
A.3.2.2 0.25%盐酸吖啶黄溶液
将0.25 g 盐酸吖啶黄溶于100 mL 蒸馏水中, 用0.45 μm 的无菌滤膜过滤除菌。
A.3.2.3 5%柠檬酸铁铵溶液
将5 g 柠檬酸铁铵溶于100 mL 蒸馏水中, 用0.45 μm 的无菌滤膜过滤除菌。
A.3.3 完全培养基
A.3.3.1 FB1 增菌肉汤
|
基础培养基(A.3.1) 1%萘啶酮酸溶液(A.3.2.1) 0.25%盐酸吖啶黄溶液(A.3.2.2) 5%柠檬酸铁铵溶液(A.3.2.3) A.3.3.2 FB2 增菌肉汤 基础培养基(A.3.1) 1%萘啶酮酸溶液(A.3.2.1) 0.25%盐酸吖啶黄溶液(A.3.2.2) 5%柠檬酸铁铵溶液(A.3.2.3) |
984 mL 1 mL 5 mL 10 mL |
|
978 mL 2 mL 10 mL 10 mL |
|
| A.4 OA 李斯特氏菌显色培养基(Agar Listeriaaccordingto Ottaviani and Agosti) | |
|
A.4.1 基础培养基 A.4.1 .1 成分 蛋白胨 胰蛋白胨(胰酪胨) 酵母膏粉 丙酮酸钠 葡萄糖 |
18.0 g 6.0 g 10.0 g 2.0 g 2.0 g |
GB 4789.30—2025
|
甘油磷酸镁 硫酸镁(无水) 氯化钠 氯化锂 磷酸氢二钠(无水) |
1.0 g 0.5 g 5.0 g 10.0 g 2.5 g |
| 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃葡萄糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucopyranoside) | |
|
0.05 g 15.0 g 930 mL* |
琼脂 蒸馏水 注: * 表示如果用两性霉素 B 替代环己酰亚胺, 基础培养基配制体积改为925 mL。 |
将上述各成分加热搅拌溶解, 必要时调节pH, 分装,121 ℃ 高压灭菌15 min, 冷却至47 ℃ ~50 ℃ 。
培养基灭菌后25 ℃ 的pH 为7.2±0.2。
A.4.2 添加剂
A.4.2.1 0.4%萘啶酮酸溶液
将0.02 g 萘啶酮酸钠盐溶于5 mL 氢氧化钠中, 并通过0.45 μm 无菌滤膜过滤除菌。
A.4.2.2 0.4%头孢他啶溶液
将0.02 g 头孢他啶溶于5 mL 蒸馏水中, 用0.45 μm 的无菌滤膜过滤除菌。
A.4.2.3 多黏菌素 B 溶液
将76 700IU 硫酸多黏菌素 B 溶于5 mL 蒸馏水中, 用0.45 μm 的无菌滤膜过滤除菌。
A.4.2.4 2%环己酰亚胺溶液
将0.05 g 环己酰亚胺溶于2.5 mL 无水乙醇中, 然后加蒸馏水 2.5 mL, 用0.45μm 的无菌滤膜过滤
除菌。
A.4.2.5 0.1 %两性霉素 B 溶液(作为环己酰亚胺溶液的替代品)
将2.5 mL 盐酸(1 mol/L) 和7.5 mL 二甲基甲酰胺(DMF) 混合成 HCl/DMF 溶液, 加0.01 g 两性
霉素溶解后, 用0.45 μm 的无菌滤膜过滤除菌。
A.4.2.6 L-α-磷脂酰肌醇溶液
将2 g 的L-α-磷脂酰肌醇溶于50 mL 的蒸馏水中(可以使用2 g 含有9%~15%的未分级磷脂酰肌
醇的大豆卵磷脂代替 L-α-磷脂酰肌醇) , 搅拌约30 min 直至获得均匀的悬浮液。 在121 ℃ 下高压灭菌
15 min, 然后冷却至47 ℃ ~50 ℃ 。
A.4.3 完全培养基
A.4.3.1 成分
|
基础培养基(A.4.1) 0.4%萘啶酮酸溶液(A.4.2.1) 0.4%头孢他啶溶液(A.4.2.2) |
930 mL 5 mL 5 mL |
GB 4789.30—2025
|
多黏菌素 B 溶液(A.4.2.3) 2%环己酰亚胺溶液(A.4.2.4) 或0.1%两性霉素 B 溶液(A.4.2.5) L-α-磷脂酰肌醇溶液(A.4.2.6) |
5 mL 5 mL 10 mL 50 mL |
胺或两性霉素 B、L-α-磷脂酰肌醇溶液。 每次添加均需要立即充分混合均匀。 完全培养基的 pH 在
25 ℃ 下应为7.2±0.2, 介质应均匀呈轻微乳白色。 混匀后倾倒在无菌的平皿中, 每个培养皿中倒入
18 mL~20 mL, 凝固后备用。
A.5 PALCAM 培养基
A.5.1 成分
|
酵母膏粉 葡萄糖 七叶苷 柠檬酸铁铵 甘露醇 酚红 氯化锂 酪蛋白胰酶消化物(酪蛋白胨) 心胰酶消化物 玉米淀粉 肉胃酶消化物 氯化钠 琼脂 蒸馏水 A.5.2 制法 |
8.0 g 0.5 g 0.8 g 0.5 g 10.0 g 0.1 g 15.0 g 10.0 g 3.0 g 1.0 g 5.0 g 5.0 g 15.0 g 1 000 mL |
的pH 为7.2±0.2。
A.5.2.1 PALCAM 选择性添加剂
|
多黏菌素 B 盐酸吖啶黄 头孢他啶 无菌蒸馏水 A.5.2.2 制法 |
10.0 mg 5.0 mg 20.0 mg 2 mL |
无菌的平皿中, 每个培养皿中倒入18 mL~20 mL, 凝固后备用。
13
GB 4789.30—2025
A.6 革兰氏染色液
A.6.1 结晶紫染色液
A.6.1 .1 成分
|
结晶紫 95% 乙醇 1% 草酸铵水溶液 A.6.1 .2 制法 |
1.0 g 20.0 mL 80.0 mL |
A.6.2 革兰氏碘液
A.6.2.1 成分
|
碘 碘化钾 蒸馏水 A.6.2.2 制法 |
1.0 g 2.0 g 300 mL |
A.6.3 沙黄复染液
A.6.3.1 成分
|
沙黄 95%乙醇 蒸馏水 A.6.3.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中, 然后用蒸馏水稀释。 A.6.4 染色法 |
0.25 g 10.0 mL 90.0 mL |
A.6.4.2 滴加革兰氏碘液, 作用1 min, 水洗。
A.6.4.3 滴加95%乙醇脱色15 s~30 s, 直至染色液被洗掉, 不要过分脱色, 水洗。
A.6.4.4 滴加复染液, 复染 1 min, 水洗、 待干、 镜检。
A.7 SIM 动力培养基
A.7.1 成分
|
胰蛋白胨(胰酪胨) 多价胨 硫酸铁铵 |
20.0 g 6.0 g 0.2 g |
GB 4789.30—2025
|
硫代硫酸钠 琼脂 蒸馏水 A.7.2 制法 |
0.2 g 3.5 g 1 000 mL |
灭菌后25 ℃ 的pH 为7.2±0.2。
A.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR) 和乙酰甲基醇(VP) 试验用]
A.8.1 成分
|
多价胨 葡萄糖 磷酸氢二钾 蒸馏水 A.8.2 制法 |
7.0 g 5.0 g 5.0 g 1 000 mL |
用。 缓冲葡萄糖蛋白胨水灭菌后25 ℃ 的pH 为7.2±0.2。
A.8.3 甲基红(MR) 试验
A.8.3.1 甲基红试剂
A.8.3.1 .1 成分
|
甲基红 95% 乙醇 蒸馏水 A.8.3.1 .2 制法 |
10 mg 30 mL 20 mL |
A.8.3.1 .3 试验方法
取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中,36 ℃ ±1 ℃ 培养2 d~5 d。 滴加甲基红试剂
1 滴, 立即观察结果。 鲜红色为阳性, 黄色为阴性。
A.8.4 乙酰甲基甲醇(VP) 试验
A.8.4.1 6%α-萘酚-乙醇溶液
成分及制法: 取α-萘酚6.0 g, 加无水乙醇溶解, 定容至100 mL。
A.8.4.2 40%氢氧化钾溶液
成分及制法: 取氢氧化钾40 g, 加蒸馏水溶解, 定容至100 mL。
15
GB 4789.30—2025
A.8.4.3 试验方法
取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中,36 ℃ ±1 ℃ 培养2 d~4 d, 加入6% α-萘酚-乙醇
溶液0.5 mL 和40%氢氧化钾溶液0.2 mL, 充分振摇试管, 观察结果。 阳性反应立刻或于数分钟内出现
红色, 如为阴性, 应放在36 ℃ ±1 ℃ 继续培养1 h 再进行观察。
A.9 羊血琼脂
A.9.1 成分
|
蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 琼脂 蒸馏水 脱纤维羊血 A.9.2 制法 |
1.0 g 0.3 g 0.5 g 1.5 g 100 mL 5 mL~8 mL |
新鲜脱纤维羊血, 摇匀, 倾注平板。
A.10 无菌磷酸盐缓冲液
A.10.1 储存液成分
|
磷酸二氢钾(KH2PO4 ) 1 mol/L 氢氧化钠 蒸馏水 A.10.2 制法 |
34.0 g 约175 mL 1 000 mL |
A.10.2.2 储存液: 称取34.0 g 的磷酸二氢钾溶于500 mL 蒸馏水中, 用大约175 mL 的1 mol/L 氢氧
化钠溶液调节pH 至7.2, 用蒸馏水定容至1 000 mL 后储存于冰箱。
A.10.2.3 工作液: 取储存液1.25 mL, 用蒸馏水稀释至1 000 mL, 分装于适宜容器中,121 ℃ 高压灭菌
15 min。
A.11 无菌生理盐水
A.11 .1 成分
|
氯化钠 蒸馏水 A.11 .2 制法 |
8.5 g 1 000 mL |
16
GB 4789.30—2025
A.12 糖发酵管
A.12.1 糖发酵基础肉汤
|
牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 十二水磷酸氢二钠(Na2 HPO4 · 12H2O) 0.2%溴麝香草酚蓝溶液 蒸馏水 A.12.2 制法 |
5.0 g 10.0 g 3.0 g 2.0 g 12.0 mL 1 000 mL |
用。 糖发酵基础肉汤灭菌后25 ℃ 的pH 为7.4±0.2。
A.12.2.2 葡萄糖发酵管: 用蒸馏水将葡萄糖配制成10% 溶液,121 ℃ 高压灭菌15 min。 无菌吸取5
mL 葡萄糖溶液加入按 A.12.2.1 配制的100 mL 糖发酵基础肉汤内, 混匀后, 以无菌操作分装于小试管
中, 备用。 葡萄糖发酵管25 ℃ 的pH 为7.4±0.2。
A.12.2.3 其他各种糖发酵管: 可按照 A.12.2.2 葡萄糖发酵管的配制方法制备其他糖类发酵管。
A.12.3 试验方法
取适量纯培养物接种于糖发酵管,36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h~48 h, 观察结果, 蓝色为阴性, 黄色为
阳性。
A.13 过氧化氢试剂
A.13.1 试剂
3%过氧化氢溶液, 临用配制。
A.13.2 过氧化氢酶试验方法
用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落, 置于洁净玻璃平皿内, 滴加3% 过氧化氢溶液2 滴, 观
察结果。
A.13.3 结果
于0.5 min 内发生气泡者为阳性, 不发生气泡者为阴性。
17
GB 4789.30—2025
附 录 B
单核细胞增生李斯特氏菌最可能数(MPN) 表
每克(毫升) 检样中单核细胞增生李斯特氏菌最可能数(MPN) 的检索见表 B.1。
表 B.1 单核细胞增生李斯特氏菌最可能数(MPN) 检索表
| 阳性管数 | MPN | 95% 置信区间 | 阳性管数 | MPN | 95% 置信区间 | ||||||
| 0.10 | 0.01 | 0.001 | 下限 | 上限 | 0.10 | 0.01 | 0.001 | 下限 | 上限 | ||
| 0 | 0 | 0 | <3.0 | — | 9.5 | 2 | 2 | 0 | 21 | 4.5 | 42 |
| 0 | 0 | 1 | 3.0 | 0.15 | 9.6 | 2 | 2 | 1 | 28 | 8.7 | 94 |
| 0 | 1 | 0 | 3.0 | 0.15 | 11 | 2 | 2 | 2 | 35 | 8.7 | 94 |
| 0 | 1 | 1 | 6.1 | 1.2 | 18 | 2 | 3 | 0 | 29 | 8.7 | 94 |
| 0 | 2 | 0 | 6.2 | 1.2 | 18 | 2 | 3 | 1 | 36 | 8.7 | 94 |
| 0 | 3 | 0 | 9.4 | 3.6 | 38 | 3 | 0 | 0 | 23 | 4.6 | 94 |
| 1 | 0 | 0 | 3.6 | 0.17 | 18 | 3 | 0 | 1 | 38 | 8.7 | 110 |
| 1 | 0 | 1 | 7.2 | 1.3 | 18 | 3 | 0 | 2 | 64 | 17 | 180 |
| 1 | 0 | 2 | 11 | 3.6 | 38 | 3 | 1 | 0 | 43 | 9 | 180 |
| 1 | 1 | 0 | 7.4 | 1.3 | 20 | 3 | 1 | 1 | 75 | 17 | 200 |
| 1 | 1 | 1 | 11 | 3.6 | 38 | 3 | 1 | 2 | 120 | 37 | 420 |
| 1 | 2 | 0 | 11 | 3.6 | 42 | 3 | 1 | 3 | 160 | 40 | 420 |
| 1 | 2 | 1 | 15 | 4.5 | 42 | 3 | 2 | 0 | 93 | 18 | 420 |
| 1 | 3 | 0 | 16 | 4.5 | 42 | 3 | 2 | 1 | 150 | 37 | 420 |
| 2 | 0 | 0 | 9.2 | 1.4 | 38 | 3 | 2 | 2 | 210 | 40 | 430 |
| 2 | 0 | 1 | 14 | 3.6 | 42 | 3 | 2 | 3 | 290 | 90 | 1 000 |
| 2 | 0 | 2 | 20 | 4.5 | 42 | 3 | 3 | 0 | 240 | 42 | 1 000 |
| 2 | 1 | 0 | 15 | 3.7 | 42 | 3 | 3 | 1 | 460 | 90 | 2 000 |
| 2 | 1 | 1 | 20 | 4.5 | 42 | 3 | 3 | 2 | 1 100 | 180 | 4 100 |
| 2 | 1 | 2 | 27 | 8.7 | 94 | 3 | 3 | 3 | >1 100 | 420 | — |
|
注1 : 本表采用3 个稀释度[0.1 g(mL) 、0.01 g(mL) 和0.001 g(mL) ], 每个稀释度接种3 管。 注2: 表内所列检样量如改用1 g(mL) 、0.1 g(mL) 和0.01 g(mL) 时, 表内数字应相应降低10 倍; 如改用0.01 g (mL) 、0.001 g(mL) 、0.000 1 g(mL) , 则表内数字应相应增高10 倍, 其余类推 |
