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GB/T 4789
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GB/T 4789.31-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的 肠杆菌科噬菌体诊断检验
[所属分类:GB/T 4789] [发布时间:2019-8-9] [发布人:wwxa] [阅读次数:] [返回]
中华人民共和国国家标准
GB 4789.31—2013
食品安全国家标准
食品微生物学检验
沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌
的肠杆菌科噬菌体诊断检验
2013-11-29 发布 2014-06-01 实施
GB 4789.31—2013
I
前 言
本标准代替 GB/T 4789.31-2003《食品卫生微生物学检验 沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌
的肠杆菌科噬菌体检验方法》。
本标准与 GB/T 4789.31-2003 相比, 主要变化如下：
——修改了操作步骤；
——增加了附录 B。
GB 4789.31—2013
1
食品安全国家标准
食品微生物学检验
沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的
肠杆菌科噬菌体诊断检验
1 范围
本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断方法检验食品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌。
本标准适用于各类食品和食源性疾病事件样品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的检验。
本标准适用于食品行业从业人员肠道沙门氏菌和志贺氏菌带菌检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌、培养的设备外，其他设备和材料如下：
a) 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃, 42 ℃±1 ℃，50 ℃±1 ℃;
b) 厌氧培养装置：41.5 ℃±0.5 ℃;
c) 显微镜：10 倍～100 倍;
d) 水平仪：噬菌体试验的工作台面应调整至水平位置;
e) 已灭菌 1 mL 一次性注射器（应为塑料材质），针头无编号，使用前测定每滴 5 L~10 L（每
mL 有 100~200 滴）可用;
f) 微量移液器及吸头（10 L 和 5 L）;
g) 定量移液器及吸头（100 L 和 50 L）;
h) 无菌吸管：10 mL、5 mL、1 mL;
i) 无菌毛细管;
j) 无菌培养皿：90 mm;
k) 无菌棉签;
l) 带盖的灭菌小试管：8 mm×50 mm;
m) 载物玻片。
3 培养基和试剂
3.1 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录 A 中的 A.1。
3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录 A 中的 A.2。
3.3 志贺氏菌（BCT）增菌液：见附录 A 中的 A.3。
3.4 营养肉汤（NB）：见附录 A 中的 A.4。
3.5 营养琼脂（NA）：见附录 A 中的 A.5。
3.6 营养半固体琼脂（NSA）：见附录 A 中的 A.6。
GB 4789.31—2013
2
3.7 三糖铁琼脂（TSI）：见附录 A 中的 A.7。
3.8 葡萄糖铵琼脂：见附录 A 中的 A.8。
3.9 肠杆菌科诊断用噬菌体，7 种和 3 种。必要时可再购置大肠埃希氏菌分型噬菌体（6 种）一套。安
瓿开启后用无菌毛细管吸出移入灭菌小试管内，如果每次使用量很少，可分装于 2~3 支试管内，保存于
5 ℃冰箱备用。
3.10 沙门氏菌因子血清，志贺氏菌分型因子血清，致泻大肠埃希氏菌分型因子血清。因子血清的种类
视需要而定。
4 检验程序
4.1 沙门氏菌的检验程序
沙门氏菌的检验程序见图 1。
GB 4789.31—2013
3
图 1 沙门氏菌的检验程序
4.2 志贺氏菌的检验程序
志贺氏菌的检验程序见图 2。
ONPG 甘露醇、山梨醇
检 样
O-1 裂解
其他均不裂解
非如左述的
各种反应结果
沙门氏菌
血清学试验证实
非沙门氏菌 沙门氏菌
血清学试验证实
沙门氏菌
血清学试验证实
非沙门氏菌 非沙门氏菌
报 告
前增菌、增菌和分离
挑取可疑菌落
TSI(斜面、底面、产气、H 2 S)
蛋白胨水（靛基质）
尿素（pH7.2）,KCN,赖氨酸
H 2 S+,靛基质－，
尿素－，KCN－，
赖氨酸＋
噬菌体试验
H 2 S+，靛基质+，
尿素－，KCN－，
赖氨酸+
各种噬菌体
均不裂解
非如左述的
各种裂解结果
H 2 S－，靛基质－，
尿素－，KCN－，
赖氨酸+/－
＋,＋, － －,－ +
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图 2 志贺氏菌的检验程序
Sh 裂解，并呈现
各种裂解模式
Sh 不裂解
血清学试验与裂解模式相符
且被 1 RTD Sh 裂解
血清学试验与裂模式不相符
或不被 1 RTD Sh 裂解
生化分群试验
葡萄糖铵试验
必要时加做乙酸钠、克氏柠檬酸盐、
黏液酸、七叶苷、水杨苷试验
七叶苷\水杨苷试验
志贺氏菌属
分群及分型结果
葡萄糖铵+
或任何其他阳性结果
非志贺氏菌
报 告
非志贺氏菌
非志贺氏菌
噬菌体试验
非如左述的各
种反应结果
检 样
挑取可疑菌落
TSI，葡萄糖半固体
增菌和分离
TSI 底层产酸,斜面产碱，H 2 S－
不产气，无动力
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4.3 致泻大肠埃希氏菌的检验程序
致泻大肠埃希氏菌的检验程序见图 3。
图 3 致泻大肠埃希氏菌的检验程序
检 样
E 和或 Sh、E－4
噬菌体不裂解
其他噬菌体裂解
不同来源分离的菌株
其裂解模式具有同一性
TSI，靛基质，
pH7.2 尿素，KCN,
赖氨酸，动力
TSI 底层＋，H 2 S－,
KCN－，尿素－
非如左述
各种反应结果
血清学试验
ETEC+
增菌和分离
E 和或 Sh、E－4
噬菌体裂解
各种噬菌体均不裂解
氧化酶－，G－杆菌
EPEC+
产肠毒素
大肠埃希氏菌
非大肠
埃希氏菌
赖氨酸－，靛基质+，
动力－(O124 动力+/－)
肠毒素+
EIEC+ 非如左述
各种反应结果
非大肠
埃希氏菌
非致泻大
肠埃希氏菌
肠道侵袭性
大肠埃希氏菌
肠道致病性
大肠埃希氏菌
乳糖发酵或不发酵
的菌落 3~5 个
噬菌体试验
STEC(O157)
stx1,stx2,hly+
产志贺毒素
大肠埃希氏菌
eae+
报告
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5 操作步骤
5.1 前增菌、增菌和分离
5.1.1 沙门氏菌的前增菌、增菌和分离按 GB 4789.4 进行。沙门氏菌增菌液灵敏度的测定见附录 B。在
食品行业从业人员的肠道沙门氏菌带菌检验时，采集的标本应增菌，不应前增菌。食物中毒标本不应前
增菌，所采集的标本同时做增菌和不增菌步骤。
5.1.2 志贺氏菌的增菌和分离按GB 4789.5进行。没有厌氧培养条件的实验室可以采用附录A中的BCT
增菌液。食物中毒患者的粪便标本同时做增菌和不增菌步骤。
5.1.3 致泻大肠埃希氏菌的增菌和分离按 GB 4789.6 和 GB 4789.36 进行。食物中毒标本同时做增菌和
不增菌步骤。
5.2 噬菌体试验
5.2.1 培养基的准备
营养琼脂平板（含琼脂 1%~1.5%，为防止变形杆菌的蔓延生长，可按 0.02%量加入十二烷基硫酸钠），
营养琼脂加热溶化后，加入每个 9 cm 平皿中约 20 mL~25 mL，放在水平台面上待其凝固。翻转平板，
在 36 ℃1 ℃培养箱内半开皿倒置约 1 h，或 50 ℃1 ℃培养箱内半开皿倒置约 30 min，以烘干培养基
表面水分。
5.2.2 试验菌液的准备
5.2.2.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，检验沙门氏菌时，挑取乳糖阴性产
H 2 S 或不产 H 2 S 的菌落，和乳糖阳性产 H 2 S 的菌落。检验大肠埃希氏菌时挑取乳糖阳性或乳糖阴性的菌
落。检验志贺氏菌时挑取典型或可疑菌落分别接种 TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置 36 ℃1 ℃
培养 20 h～24 h 后选取三糖铁底层产酸、斜面产碱，不产 H 2 S，不产气无动力的菌落。下述两种方法可
供制备试验菌液时选用。
5.2.2.2 方法一：将待检菌落接种于营养肉汤管内，于 36 ℃1 ℃培养 14 h~24 h。挑取此肉汤培养物
1 满环（约 5 L），稀释于盛有 1 mL~2 mL 的营养肉汤管内，使成为 1:200~1:400 稀释菌液，含菌量约为
1×10 6 CFU/mL。
5.2.2.3 方法二：用接种针在鉴别平板上挑取可疑菌落，稀释于盛有 1mL~2 mL 营养肉汤管内，含菌
量约为 1×10 6 CFU/mL。
5.2.3 涂抹试验菌液
5.2.3.1 斑点涂抹法：将营养琼脂表面自圆心起分为三等分或二等分，每等分可供涂抹 1 株细菌培养物。
每挑取试验菌液 1 满环，涂抹直径约 1 cm 的菌斑一个。每株培养物涂抹菌斑 7 个，外圈 5 个，内圈 2
个。
5.2.3.2 棉签涂抹法：用无菌棉签蘸取试验菌液并略挤去过多液体，在如上琼脂平板表面三分之一的区
域内涂抹。三个涂抹区之间保持适当距离，待菌液干燥。
5.2.4 滴加噬菌体
用定量为 1 mL 的一次性注射器（针头无编号，1 mL 约有 100~200 滴，每滴相当于 5 L~10 L），
在每一个菌斑上滴加噬菌体。或用定量为 10 L 或 5 L 的微量移液器在每一个菌斑上滴加噬菌体一滴，
每滴加一种噬菌体应更换一副注射器或一个吸头，但是每副注射器或每一个吸头可以滴完各株细菌的同
一种噬菌体。滴加的噬菌体依次为 O-I、C、Sh、E、CE、E-4 和 Ent。滴加噬菌体时应将琼脂平板放在
水平台面上，液滴应悬空滴下，不要污染针头或滴头。待 7 种噬菌体均滴加完毕后，略等数分钟待噬菌
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体液干燥。翻转平板，放在 36 ℃培养 5 h~6 h，和 14 h~24 h 各观察一次结果。
如果仅有少数几株细菌作噬菌体试验，可用直径为 3 mm 的接种环挑取噬菌体，每一满环相当于 5
L，依次加在菌斑上，尽量减少在室温放置的时间。
5.2.5 试验结果的判定
必要时（例如不能测定到完整的血清型），可吸取少许剩余的蛋白胨水培养物作靛基质试验，大肠埃
希氏菌一般为靛基质阳性，沙门氏菌为靛基质阴性。噬菌体试验的结果见表 1。
表 1 噬菌体试验结果
序号
噬菌体裂解模式
判定结果
O-I C Sh E CE E-4 Ent
1 CL - - - - - - 沙门氏菌属
2 CL - - - - CL - 沙门氏菌属(靛基质-),大肠埃希氏菌(靛基质+)
3 - CL - - (-) (-) - 弗劳地氏柠檬酸杆菌群
a
4 - - CL v v v - 志贺氏菌属
b ,大肠埃希氏菌
5 CL - CL v v v - 大肠埃希氏菌
6 v - - CL v v - 大肠埃希氏菌
7 - - - - CL v - 弗劳地氏柠檬酸杆菌群
a ,大肠埃希氏菌
8 - - - - - CL - 大肠埃希氏菌
9 - (-) v - - - CL 阴沟肠杆菌
0 - - - - - - - 噬菌体不裂解培养物,用生化试验鉴定
注：CL 表示融合性裂解；– 表示不裂解；（－）表示少量菌株裂解；v 表示裂解或不裂解。
a 含弗劳地氏柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌、布雷克氏柠檬酸杆菌、沃克曼氏柠檬酸杆菌和吉伦氏柠檬酸杆菌。
b 按表 3 检索并做血清学分型试验。
5.2.6 供快速检验沙门氏菌的噬菌体简化诊断法
采用如下 3 种噬菌体：沙门氏菌 O-I 噬菌体；E 多价噬菌体，内含 E 和 Sh；C 多价噬菌体，内含 C、
CE 和 Ent。培养基和试验菌液的准备均同前法。
涂抹试验菌液：斑点涂抹法将琼脂平板表面分为 4 等分或 6 等分，每等分可供涂抹一株细菌培养物，
每株培养物涂抹 3 个菌斑，外圈 2 个，内圈 1 个。棉签涂抹法可将试验菌液在琼脂平板上涂抹成带状，
每个平板约可涂抹 5 条菌带，置数分钟，待菌斑干燥。
依次滴加上述 3 种噬菌体。斑点涂抹法，一般可把 O-I 噬菌体滴加在内圈的菌斑上。带状涂抹法，
可将 O-I 噬菌体滴加在菌带的左边。待噬菌体液滴干燥后，翻转平板，在 36 ℃培养 5 h ~6 h，和 14 h ~24
h 各观察一次结果。按表 2 判定结果。
表 2 噬菌体试验简化诊断法
O-I E 多价 C 多价 判定结果
CL - - 沙门氏菌属
v CL v 大肠埃希氏菌
- - CL 弗劳地氏柠檬酸杆菌群
a
- - - 噬菌体不裂解培养物
注：CL 表示融合性裂解；– 表示不裂解；v 表示裂解或不裂解。
a 除表 1 的注中所述外，并含阴沟肠杆菌和少数大肠埃希氏菌。
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5.3 噬菌体不裂解培养物的补充生化试验
少数沙门氏菌培养物不被 O-I 噬菌体裂解，少数大肠埃希氏菌培养物不被相应噬菌体裂解，不被各
种噬菌体裂解的培养物接种三糖铁琼脂，按 GB 4789.4 做 5 项生化试验，血清学分型鉴定后判定结果。
5.4 血清学分型鉴定及其他补充试验
5.4.1 沙门氏菌分型鉴定
按 GB 4789.4 进行。如果判定为沙门氏菌时，应得出完整的血清学分型鉴定的结果。
5.4.2 致泻大肠埃希氏菌鉴定
5.4.2.1 按 GB 4789.6 和 GB 4789.36 进行。分离的菌株应该同时被同样的几个噬菌体裂解后，用大肠
埃希氏菌分型噬菌体试验，这些菌株应该具有相同的裂解模式，同时测定 1 RTD 噬菌体的裂解情况。
5.4.2.2 产肠毒素大肠埃希氏菌，应有肠毒素试验的证实。
5.4.2.3 侵袭性大肠埃希氏菌，典型的生化特性为：赖氨酸脱羧酶试验阴性、无动力、产气或不产气
（O124 血清型亦可以为有动力、不产气），靛基质试验阳性。可进一步做豚鼠角膜试验，结果应该为阳
性，质粒电泳应证明具有 120~140 Mdal 大质粒，PCR 试验证明具有 ipaC 或 ipaH 基因。
5.4.2.4 产志贺毒素大肠埃希氏菌 O157:H7，典型的生化特性为：乳糖、蔗糖产酸，葡萄糖产酸并多
数产气，硫化氢阴性，靛基质阳性，山梨醇迟缓发酵。PCR 试验证明具有产志贺毒素基因 stx1，stx2 和
溶血毒素基因 hly。1RTD 的 E-2 噬菌体裂解试验，能被 1RTD 的 E-2 噬菌体裂解（裂解程度包括从 CL
到少数几个噬斑）。对于产志贺毒素和溶血毒素其他血清型的大肠埃希氏菌，按照 5.4.2.3 的程序进行鉴
定。
5.4.2.5 肠道致病性大肠埃希氏菌 具有大肠埃希氏菌的典型生化特性，eae 基因（黏附屏蔽基因）的
PCR 试验为阳性。产志贺毒素大肠埃希氏菌 eae 试验也可为阳性。EAF（黏附因子质粒基因）或 bfp（菌
毛捆绑形成基因）的 PCR 试验可进一步证实。
5.4.3 志贺氏菌分型鉴定
5.4.3.1 挑取三糖铁琼脂上的培养物，按噬菌体裂解模式，选用相应的志贺氏菌分型因子血清，做玻片
凝集试验。血清学分型鉴定结果见表 3。
表 3 噬菌体试验的结果和志贺氏菌血清学分型鉴定的结果
序
号
噬菌体裂解模式
志贺氏菌血清学分型鉴定的结果
O-I C Sh E CE E-4 Ent
1 - - CL CL CL CL - 福氏 1-5,(鲍氏 11)
2 - - CL CL CL - - 福氏 1,4,痢疾 2,鲍氏 5,7,11,16,17,(宋内氏 I)
3 - - CL CL - - - 宋内氏 I,痢疾 2,福氏 4,鲍氏 5,16
4 - - CL CL - CL - 宋内氏 II,福氏 3
5 - - CL - - - - 福氏 6,鲍氏 1~4,偶数型 6~18(除 16 外),痢疾 3~12
6 - - CL - CL - - 鲍氏 9,15
7 - - CL - - CL - 痢疾 1,(宋内氏 II)
8 CL - CL - - - - 鲍氏 13 a
注：CL 表示融合性裂解；– 表示不裂解。
a 鲍氏 13 型 DNA 同源性测定不符合志贺氏菌。
5.4.3.2 如按噬菌体裂解模式结果为福氏志贺氏菌 1~5 型，先用福氏多价血清做凝集试验。如呈现凝
集，再分别用各型和群因子血清检查，以确定所属血清型和亚型（见 GB 4789.5）。
5.4.3.3 如按噬菌体裂解模式结果为福氏 6 型，鲍氏各型或痢疾 3~12 型，先用福氏 6 型血清做凝集试
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验。福氏 6 型血清不凝集者，用鲍氏多价血清或痢疾 3~12 型多价血清做凝集试验，如果呈现凝集，再
分别用各型因子血清检查。
5.4.3.4 如按噬菌体裂解模式结果为宋内氏 II 相菌而不被宋内氏血清凝集时，可直接按噬菌体裂解模
式和粗糙型菌落特征判定之。
5.4.3.5 按噬菌体裂解模式结果做血清学试验不凝集者，或虽发现其被某一个分型因子血清凝集而与噬
菌体裂解模式不相符者，或虽与噬菌体裂解模式相符但不被 1 RTD 的 Sh 噬菌体裂解者，均应做葡萄糖
铵试验以与大肠埃希氏菌相鉴别。葡萄糖铵试验阳性者为大肠埃希氏菌。必要时可做如下生化试验：醋
酸盐、克氏柠檬酸盐和粘液酸的利用试验，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶试验，七叶苷分解试验。除宋内氏菌
鲍氏 13 型为鸟氨酸脱羧酶阳性，并有少数宋内氏菌菌株可利用黏液酸外，志贺氏菌属的培养物均为阴性
结果。上述试验任何阳性结果均提示为大肠埃希氏菌（按 GB 4789.5）。
5.4.3.6 检出的志贺氏菌培养物应符合该群的生化特性。福氏志贺氏菌 6 型符合鲍氏志贺氏菌的特性。
靛基质阳性的志贺氏菌血清型有痢疾 2 型、7 型和 8 型，鲍氏 5、7、9、11、13、15、16 和 17 型。福氏
志贺氏菌 1~5 型的靛基质反应较弱。靛基质阴性的志贺氏菌血清型为痢疾 1 型、3~6 型、9~12 型、福氏
6 型、鲍氏 1~4、6、8、10、12、14 和 18 型、宋内氏菌。
5.4.3.7 鲍氏志贺氏菌13型是唯一可被沙门氏菌O-I裂解的菌株，该菌株只被高效价的Sh噬菌体裂解。
5.5 结果报告
5.5.1 沙门氏菌检验的结果报告
5.5.1.1 O-I 噬菌体裂解，其他噬菌体均不裂解者，经沙门氏菌血清分型后报告。
5.5.1.2 各种噬菌体不裂解，生化试验结果为沙门氏菌，经沙门氏菌血清分型后报告，不可报告为未定
型。
5.5.2 志贺氏菌检验的结果报告
5.5.2.1 Sh 噬菌体裂解，呈现各种裂解模式，血清学试验与裂解模式相符者，可报告志贺氏菌血清型。
罕见血清型要求被 1 RTD Sh 噬菌体裂解，并符合志贺氏菌生化分群结果。
5.5.2.2 非如 5.5.2.1 的试验结果均报告非志贺氏菌。
5.5.3 致泻大肠埃希氏菌检验的结果报告
5.5.3.1 E 和或 Sh、E-4 噬菌体裂解，不同来源菌株的裂解模式具有同一性，或各种噬菌体均不裂解，
经血清学分型确定者可分别报告为产肠毒素大肠埃希氏菌（肠毒素试验结果阳性），侵袭性大肠埃希氏菌
（赖氨酸阴性、动力阴性，O124 可为动力阳性），产志贺毒素大肠埃希氏菌（O157: :H7 和 O157: :NM，
stx1, stx2, hly 试验阳性）或肠道致病性大肠埃希氏菌（eae 试验阳性）。
5.5.3.2 非如 5.5.3.1 的结果均报告为非大肠埃希氏菌或非致泻大肠埃希氏菌。
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附录 A
培养基及试剂
A.1 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液
A.1.1 成分
蛋白胨 5.0 g
乳糖 4.0 g
亚硒酸氢钠 4.0 g
1% L-胱氨酸溶液 1.0 mL
磷酸氢二钠（无水） 4.5 g
磷酸二氢钠（无水） 5.5 g
蒸馏水 加至1 000.0mL
A.1.2 制法
称取 L-胱氨酸 0.1 g（或 DL-胱氨酸 0.2 g），加入 1 mol/L 氢氧化钠溶液 1.5 mL，使胱氨酸溶解，再
加入蒸馏水 8.5 mL，即为 1% L-胱氨酸溶液。
将蛋白胨、乳糖、胱氨酸加入于蒸馏水 800 mL 中，为基础液。
将亚硒酸氢钠加入于 100 mL 蒸馏水中，为 A 液。
将磷酸氢二钠和磷酸二氢钠加入于 100 mL 蒸馏水中，为 B 液。
取基础液 4.0 mL，A 液 0.5 mL，B 液 0.5 mL 混合，测定 pH。校正 pH 至 7.0~7.1，将此 3 份溶液分
别包装，在 121℃高压灭菌 15 min（从高压灭菌器开始加热到取出不超过 1 h），待其冷却至常温后放入
5 ℃冰箱内保存。临用前将 3 份溶液按比例混合，分装试管。3 份溶液混合后，其 pH 值小于 7.0，则应
调整磷酸氢二钠、磷酸二氢钠的用量和亚硒酸氢钠的用量。使用前应测定其增菌灵敏度，方法见附录 B。
不同亚硒酸盐和磷酸盐的用量见表 A.1。
表 A.1 不同亚硒酸盐和磷酸盐的用量
亚硒酸盐的种类和用量
g
磷酸盐的种类和用量
g
主要种类 用量 NaH 2 PO 4 (无水) Na 2 HPO 4 (无水)
亚硒酸钠•H 2 O(100%) 5.0 8.6 0.8
亚硒酸钠•H 2 O (75%) 4.75 7.8 1.25
亚硒酸钠•H 2 O (50%) 4.5 7.0 2.65
亚硒酸氢钠(75%) 4.25 6.25 3.58
亚硒酸氢钠(100%) 4.0 5.5 4.5
亚硒酸氢钠(75%) 3.85 4.7 5.4
亚硒酸氢钠(50%) 3.7 3.9 6.35
亚硒酸(75%) 3.55 3.1 7.28
亚硒酸(100%) 3.4 2.3 8.2
注：表中所列均为在 1000mL 增菌液中的用量。
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A.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液
A.2.1 成分
A.2.1.1 基础液
多价胨或初蛋白胨 3.0 g
胆盐 1.0 g
碳酸钙 10.0 g
硫代硫酸钠 30.0 g
0.1%煌绿水溶液 10.0 mL
蒸馏水 加至1 000.0 mL
A.2.1.2 碘液
碘 6.0 g
碘化钾 5.0 g
蒸馏水 20.0 mL
A.2.2 制法
A.2.2.1 基础液的配制：将基础液的成分依次加到 800mL 蒸馏水中，成分溶解后加蒸馏水至 1000mL，
校正 pH 至 7.00.1，经高压灭菌 121℃，15 min。冷却后保存备用。
A.2.2.2 碘液的配制：先将碘化钾溶解于蒸馏水中，再加入碘片，振摇至碘片完全溶解。贮于棕色瓶内，
密塞备用。临用前将基础液与碘液混合，分装试管。使用前应测定其增菌灵敏度，方法见附录 B。
注：为了防止变形杆菌的过度生长，可以在 1000 mL 中加入磺胺噻脞 1.25 mg。
A.3 志贺氏菌（BCT）增菌液
A.3.1 成分
蛋白胨 20.0 g
复合氨基酸 2.0 g
牛肉膏 5.0 g
三号胆盐 4.5 g
柠檬酸钠 4.5 g
硫代硫酸钠 4.5 g
蒸馏水 加至1 000.0 mL
A.3.2 制法
将 A.3.1 成分混合加热溶解，冷却至 25℃校正 pH 至 7.20.1，高压灭菌 121℃，15 min，冷却后分
装试管备用。
A.4 营养肉汤（NB）
GB 4789.31—2013
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A.4.1 成分
蛋白胨 15.0 g
牛肉膏 3.0 g
氯化钠 5.0 g
蒸馏水 加至1 000.0 mL
A.4.2 制法
将 A.4.1 成分混合加热溶解，冷却至 25℃校正 pH 至 7.20.2，高压灭菌 121 ℃，15 min，备用。
A.5 营养琼脂（NA）
成分和制法：在 1000 mL 营养肉汤（NB）内加入琼脂 15 g（如用作噬菌体试验，只加琼脂 10 g），
高压灭菌 120 ℃，15 min，备用。
A.6 营养半固体琼脂（NSA）
成分和制法：在 1000 mL 营养肉汤（NB）内加入琼脂 3 g，高压灭菌 120 ℃，15 min，备用。
A.7 三糖铁琼脂（TSI）
A.7.1 成分
蛋白胨 20.0 g
牛肉膏 3.0 g
乳 糖 10.0 g
蔗 糖 10.0 g
葡萄糖 1.0 g
硫酸亚铁铵（含6个结晶水） 0.5 g
酚红 0.025 g或5 g／L溶液5 mL
氯化钠 5.0 g
硫代硫酸钠 0.5 g
琼 脂 12.0 g
蒸馏水 加至1 000.0 mL
A.7.2 制法
除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，搅拌均匀，静置约 10 min，加热煮沸至完全
溶解，校正 pH 至 7.4±0.1。另将琼脂加入 600 mL 蒸馏水中，搅拌均匀，静置约 10 min，加热煮沸至完
全溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入酚红指示剂，混匀，分装试管（12 mm×100 mm），每管约 2
mL～4 mL，高压灭菌 120℃ 10 min 或 115℃ 15 min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。
A.8 葡萄糖铵琼脂
A.8.1 成分
GB 4789.31—2013
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氯化钠 5.0 g
MgSO 4 ·7H 2 O 0.2 g
NH 4 H 2 PO 4 1.0 g
磷酸氢二钾（无水） 1.0 g
葡萄糖 5.0 g
琼脂 20.0 g
0.2%溴麝香草酚蓝 40.0 mL
蒸馏水 加至 1 000.0 mL
A.8.2 制法
将 A.8.1 成分混合加热溶解，冷却至 25℃校正 pH 至 6.80.1，高压灭菌 121℃，15 min，放置成斜
面，冷却后备用。
A.8.3 试验方法
用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不到混浊，以每一接种环
内含菌数在20 CFU~100 CFU之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接种普通斜面一支
作为对照。于36 ℃1 ℃培养24 h。阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的菌落生长；阴性者不生长，但
在对照培养基上生长良好。如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。
GB 4789.31—2013
14
附录 B
增菌液灵敏度测定方法
B.1 沙门氏菌增菌液灵敏度测定方法
B.1.1 试验菌株为沙门氏菌鼠伤寒血清型，沙门氏菌肠炎血清型。
B.1.2 干扰菌株为大肠埃希氏菌。
B.1.3 将试验菌株和干扰菌株接种营养肉汤管，在 36 ℃1 ℃培养 18 h~24 h。菌液浓度约为
10 9 CFU/mL。大肠埃希氏菌菌液浓度不需测定，应测定沙门氏菌鼠伤寒血清型和肠炎血清型的菌液浓度。
B.1.4 每组 8 支 15 mm150 mm 试管，编号，单号试管内每管加入灭菌生理盐水 4.5 mL，双号试管内
每管加入灭菌生理盐水 5.0 mL。
B.1.5 在 1 号管内加入沙门氏菌营养肉汤培养液 0.5 mL，在 2 号管内加入沙门氏菌培养液 0.05 mL。再
从 2 号管内吸取沙门氏菌稀释菌液，加入到 3 号管内 0.5 mL，加入到 4 号管内 0.05 mL。按此法继续稀
释到 8 号管。每次稀释应更换一支吸管。
B.1.6 吸取 6 号管内的稀释菌液各 0.1 mL，分别点加在 2 个营养琼脂平板上，用弯曲的接种环将菌液
均匀涂布，待平板表面的菌液干燥后，于 36 ℃1 ℃培养 14 h~24 h。计算平板上生长的沙门氏菌菌落
数，取其平均数，约为 100 CFU。
B.1.7 接 B.1.5，排好若干组每组 10 支需要测定的增菌液，第 8 管到第 10 管都加入 8 号稀释管的稀释
菌液各 0.1 mL；第 7 管到第 1 管逆序加入该稀释度的稀释菌液各 0.1 mL。
B.1.8 逆序向每管内加入未稀释的大肠埃希氏菌菌液 0.1 mL。振摇各管，使加入的菌液混合均匀。在
36 ℃1 ℃培养 18 h~24 h。
B.1.9 振摇各管，使培养物混合均匀。挑取培养物，划线接种到鉴别培养基上，使能够出现单个菌落。
在 36 ℃1 ℃培养 18 h~24 h。
B.1.10 观察在鉴别培养基上沙门氏菌和大肠埃希氏菌菌落的生长情况。按照表 B.1 记录增菌培养的结
果。
表 B.1 增菌培养的结果
增菌培养的结果 记录
沙门氏菌菌落数在 90%以上，大肠埃希氏菌的菌落少见 ++++
沙门氏菌菌落数约占 80% +++
沙门氏菌和大肠埃希氏菌的菌落数分别占 50% ++
平板上大肠埃希氏菌的菌落为主，可见少数几个沙门氏菌的菌落 +
平板上生长的是大肠埃希氏菌的菌落，未见沙门氏菌的菌落 -
注：判定增菌液的灵敏度，是以++++和+++的结果为准。8~10 号管 3 管中有 1 管或 1 管以上达到++++，或+++的增菌效果，
就可以判定已经达到这一管的灵敏度（约 1 CFU ）。++和+的结果可检出，也可能被疏忽。
B.2 沙门氏菌增菌液灵敏度简易测定方法
B.2.1 用于核对已经过测定的增菌液的灵敏度。
B.2.2 试验菌株、干扰菌株，及将菌株接种到营养肉汤和培养的方法均同 B.1.1~B.1.3.。
B.2.3 准备 15 mm150 mm 灭菌试管 2 支，分别加入灭菌生理盐水 5 mL。用直径为 3 mm 的接种环挑
取试验菌株的营养肉汤培养物 1 满环（5 L），稀释到 5 mL 生理盐水中，此时相当于 1∶10 3 稀释。再
GB 4789.31—2013
15
挑取此稀释液 1 满环，稀释到另一支 5 mL 生理盐水管中，此时相当于 1:10 6 稀释。吸取此稀释液 0.1 mL，
涂布接种于一个营养琼脂平板上，用于菌落计数，菌落数约为 80 CFU ~100 CFU。再将此稀释液做成 1:10
和 1:100 稀释。
B.2.4 在 2~4 支增菌液管内，各加入未稀释的大肠埃希氏菌肉汤培养物 0.1 mL，再在其中一管内加入
1:10 稀释的试验菌液（B.2.3）0.1 mL，另外的 1~3 支增菌液管内各加入 1:100 稀释的试验菌液（B.2.3）
0.1 mL，将试管内液体振摇使其均匀。在 36 ℃1 ℃培养 14 h~24 h。划线接种鉴别培养基，在 36 ℃1 ℃
培养 14 h~24 h 后观察结果。接种 1:10 稀释的试验菌液（B.2.3）的管相当于 B.1 试验方法中的第 7 管，
后面各管相当于第 8 管～第 10 管。
B.3 志贺氏菌增菌液灵敏度测定方法
B.3.1 试验菌株 福氏志贺氏菌 2a 型，鲍氏志贺氏菌 4 型，痢疾志贺氏菌 2 型，宋内氏志贺氏菌各 1
株。
B.3.2 干扰菌株 大肠埃希氏菌 10 株。
B.3.3 对比增菌液，以 GN 肉汤作为对比增菌液，以判定所测定的增菌液是否优于 GN 肉汤。
GB 4789.31—2013
食品安全国家标准
食品微生物学检验
沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌
的肠杆菌科噬菌体诊断检验
2013-11-29 发布 2014-06-01 实施
GB 4789.31—2013
I
前 言
本标准代替 GB/T 4789.31-2003《食品卫生微生物学检验 沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌
的肠杆菌科噬菌体检验方法》。
本标准与 GB/T 4789.31-2003 相比, 主要变化如下：
——修改了操作步骤；
——增加了附录 B。
GB 4789.31—2013
1
食品安全国家标准
食品微生物学检验
沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的
肠杆菌科噬菌体诊断检验
1 范围
本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断方法检验食品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌。
本标准适用于各类食品和食源性疾病事件样品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的检验。
本标准适用于食品行业从业人员肠道沙门氏菌和志贺氏菌带菌检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌、培养的设备外，其他设备和材料如下：
a) 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃, 42 ℃±1 ℃，50 ℃±1 ℃;
b) 厌氧培养装置：41.5 ℃±0.5 ℃;
c) 显微镜：10 倍～100 倍;
d) 水平仪：噬菌体试验的工作台面应调整至水平位置;
e) 已灭菌 1 mL 一次性注射器（应为塑料材质），针头无编号，使用前测定每滴 5 L~10 L（每
mL 有 100~200 滴）可用;
f) 微量移液器及吸头（10 L 和 5 L）;
g) 定量移液器及吸头（100 L 和 50 L）;
h) 无菌吸管：10 mL、5 mL、1 mL;
i) 无菌毛细管;
j) 无菌培养皿：90 mm;
k) 无菌棉签;
l) 带盖的灭菌小试管：8 mm×50 mm;
m) 载物玻片。
3 培养基和试剂
3.1 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录 A 中的 A.1。
3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录 A 中的 A.2。
3.3 志贺氏菌（BCT）增菌液：见附录 A 中的 A.3。
3.4 营养肉汤（NB）：见附录 A 中的 A.4。
3.5 营养琼脂（NA）：见附录 A 中的 A.5。
3.6 营养半固体琼脂（NSA）：见附录 A 中的 A.6。
GB 4789.31—2013
2
3.7 三糖铁琼脂（TSI）：见附录 A 中的 A.7。
3.8 葡萄糖铵琼脂：见附录 A 中的 A.8。
3.9 肠杆菌科诊断用噬菌体，7 种和 3 种。必要时可再购置大肠埃希氏菌分型噬菌体（6 种）一套。安
瓿开启后用无菌毛细管吸出移入灭菌小试管内，如果每次使用量很少，可分装于 2~3 支试管内，保存于
5 ℃冰箱备用。
3.10 沙门氏菌因子血清，志贺氏菌分型因子血清，致泻大肠埃希氏菌分型因子血清。因子血清的种类
视需要而定。
4 检验程序
4.1 沙门氏菌的检验程序
沙门氏菌的检验程序见图 1。
GB 4789.31—2013
3
图 1 沙门氏菌的检验程序
4.2 志贺氏菌的检验程序
志贺氏菌的检验程序见图 2。
ONPG 甘露醇、山梨醇
检 样
O-1 裂解
其他均不裂解
非如左述的
各种反应结果
沙门氏菌
血清学试验证实
非沙门氏菌 沙门氏菌
血清学试验证实
沙门氏菌
血清学试验证实
非沙门氏菌 非沙门氏菌
报 告
前增菌、增菌和分离
挑取可疑菌落
TSI(斜面、底面、产气、H 2 S)
蛋白胨水（靛基质）
尿素（pH7.2）,KCN,赖氨酸
H 2 S+,靛基质－，
尿素－，KCN－，
赖氨酸＋
噬菌体试验
H 2 S+，靛基质+，
尿素－，KCN－，
赖氨酸+
各种噬菌体
均不裂解
非如左述的
各种裂解结果
H 2 S－，靛基质－，
尿素－，KCN－，
赖氨酸+/－
＋,＋, － －,－ +
GB 4789.31—2013
4
图 2 志贺氏菌的检验程序
Sh 裂解，并呈现
各种裂解模式
Sh 不裂解
血清学试验与裂解模式相符
且被 1 RTD Sh 裂解
血清学试验与裂模式不相符
或不被 1 RTD Sh 裂解
生化分群试验
葡萄糖铵试验
必要时加做乙酸钠、克氏柠檬酸盐、
黏液酸、七叶苷、水杨苷试验
七叶苷\水杨苷试验
志贺氏菌属
分群及分型结果
葡萄糖铵+
或任何其他阳性结果
非志贺氏菌
报 告
非志贺氏菌
非志贺氏菌
噬菌体试验
非如左述的各
种反应结果
检 样
挑取可疑菌落
TSI，葡萄糖半固体
增菌和分离
TSI 底层产酸,斜面产碱，H 2 S－
不产气，无动力
GB 4789.31—2013
5
4.3 致泻大肠埃希氏菌的检验程序
致泻大肠埃希氏菌的检验程序见图 3。
图 3 致泻大肠埃希氏菌的检验程序
检 样
E 和或 Sh、E－4
噬菌体不裂解
其他噬菌体裂解
不同来源分离的菌株
其裂解模式具有同一性
TSI，靛基质，
pH7.2 尿素，KCN,
赖氨酸，动力
TSI 底层＋，H 2 S－,
KCN－，尿素－
非如左述
各种反应结果
血清学试验
ETEC+
增菌和分离
E 和或 Sh、E－4
噬菌体裂解
各种噬菌体均不裂解
氧化酶－，G－杆菌
EPEC+
产肠毒素
大肠埃希氏菌
非大肠
埃希氏菌
赖氨酸－，靛基质+，
动力－(O124 动力+/－)
肠毒素+
EIEC+ 非如左述
各种反应结果
非大肠
埃希氏菌
非致泻大
肠埃希氏菌
肠道侵袭性
大肠埃希氏菌
肠道致病性
大肠埃希氏菌
乳糖发酵或不发酵
的菌落 3~5 个
噬菌体试验
STEC(O157)
stx1,stx2,hly+
产志贺毒素
大肠埃希氏菌
eae+
报告
GB 4789.31—2013
6
5 操作步骤
5.1 前增菌、增菌和分离
5.1.1 沙门氏菌的前增菌、增菌和分离按 GB 4789.4 进行。沙门氏菌增菌液灵敏度的测定见附录 B。在
食品行业从业人员的肠道沙门氏菌带菌检验时，采集的标本应增菌，不应前增菌。食物中毒标本不应前
增菌，所采集的标本同时做增菌和不增菌步骤。
5.1.2 志贺氏菌的增菌和分离按GB 4789.5进行。没有厌氧培养条件的实验室可以采用附录A中的BCT
增菌液。食物中毒患者的粪便标本同时做增菌和不增菌步骤。
5.1.3 致泻大肠埃希氏菌的增菌和分离按 GB 4789.6 和 GB 4789.36 进行。食物中毒标本同时做增菌和
不增菌步骤。
5.2 噬菌体试验
5.2.1 培养基的准备
营养琼脂平板（含琼脂 1%~1.5%，为防止变形杆菌的蔓延生长，可按 0.02%量加入十二烷基硫酸钠），
营养琼脂加热溶化后，加入每个 9 cm 平皿中约 20 mL~25 mL，放在水平台面上待其凝固。翻转平板，
在 36 ℃1 ℃培养箱内半开皿倒置约 1 h，或 50 ℃1 ℃培养箱内半开皿倒置约 30 min，以烘干培养基
表面水分。
5.2.2 试验菌液的准备
5.2.2.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，检验沙门氏菌时，挑取乳糖阴性产
H 2 S 或不产 H 2 S 的菌落，和乳糖阳性产 H 2 S 的菌落。检验大肠埃希氏菌时挑取乳糖阳性或乳糖阴性的菌
落。检验志贺氏菌时挑取典型或可疑菌落分别接种 TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置 36 ℃1 ℃
培养 20 h～24 h 后选取三糖铁底层产酸、斜面产碱，不产 H 2 S，不产气无动力的菌落。下述两种方法可
供制备试验菌液时选用。
5.2.2.2 方法一：将待检菌落接种于营养肉汤管内，于 36 ℃1 ℃培养 14 h~24 h。挑取此肉汤培养物
1 满环（约 5 L），稀释于盛有 1 mL~2 mL 的营养肉汤管内，使成为 1:200~1:400 稀释菌液，含菌量约为
1×10 6 CFU/mL。
5.2.2.3 方法二：用接种针在鉴别平板上挑取可疑菌落，稀释于盛有 1mL~2 mL 营养肉汤管内，含菌
量约为 1×10 6 CFU/mL。
5.2.3 涂抹试验菌液
5.2.3.1 斑点涂抹法：将营养琼脂表面自圆心起分为三等分或二等分，每等分可供涂抹 1 株细菌培养物。
每挑取试验菌液 1 满环，涂抹直径约 1 cm 的菌斑一个。每株培养物涂抹菌斑 7 个，外圈 5 个，内圈 2
个。
5.2.3.2 棉签涂抹法：用无菌棉签蘸取试验菌液并略挤去过多液体，在如上琼脂平板表面三分之一的区
域内涂抹。三个涂抹区之间保持适当距离，待菌液干燥。
5.2.4 滴加噬菌体
用定量为 1 mL 的一次性注射器（针头无编号，1 mL 约有 100~200 滴，每滴相当于 5 L~10 L），
在每一个菌斑上滴加噬菌体。或用定量为 10 L 或 5 L 的微量移液器在每一个菌斑上滴加噬菌体一滴，
每滴加一种噬菌体应更换一副注射器或一个吸头，但是每副注射器或每一个吸头可以滴完各株细菌的同
一种噬菌体。滴加的噬菌体依次为 O-I、C、Sh、E、CE、E-4 和 Ent。滴加噬菌体时应将琼脂平板放在
水平台面上，液滴应悬空滴下，不要污染针头或滴头。待 7 种噬菌体均滴加完毕后，略等数分钟待噬菌
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体液干燥。翻转平板，放在 36 ℃培养 5 h~6 h，和 14 h~24 h 各观察一次结果。
如果仅有少数几株细菌作噬菌体试验，可用直径为 3 mm 的接种环挑取噬菌体，每一满环相当于 5
L，依次加在菌斑上，尽量减少在室温放置的时间。
5.2.5 试验结果的判定
必要时（例如不能测定到完整的血清型），可吸取少许剩余的蛋白胨水培养物作靛基质试验，大肠埃
希氏菌一般为靛基质阳性，沙门氏菌为靛基质阴性。噬菌体试验的结果见表 1。
表 1 噬菌体试验结果
序号
噬菌体裂解模式
判定结果
O-I C Sh E CE E-4 Ent
1 CL - - - - - - 沙门氏菌属
2 CL - - - - CL - 沙门氏菌属(靛基质-),大肠埃希氏菌(靛基质+)
3 - CL - - (-) (-) - 弗劳地氏柠檬酸杆菌群
a
4 - - CL v v v - 志贺氏菌属
b ,大肠埃希氏菌
5 CL - CL v v v - 大肠埃希氏菌
6 v - - CL v v - 大肠埃希氏菌
7 - - - - CL v - 弗劳地氏柠檬酸杆菌群
a ,大肠埃希氏菌
8 - - - - - CL - 大肠埃希氏菌
9 - (-) v - - - CL 阴沟肠杆菌
0 - - - - - - - 噬菌体不裂解培养物,用生化试验鉴定
注：CL 表示融合性裂解；– 表示不裂解；（－）表示少量菌株裂解；v 表示裂解或不裂解。
a 含弗劳地氏柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌、布雷克氏柠檬酸杆菌、沃克曼氏柠檬酸杆菌和吉伦氏柠檬酸杆菌。
b 按表 3 检索并做血清学分型试验。
5.2.6 供快速检验沙门氏菌的噬菌体简化诊断法
采用如下 3 种噬菌体：沙门氏菌 O-I 噬菌体；E 多价噬菌体，内含 E 和 Sh；C 多价噬菌体，内含 C、
CE 和 Ent。培养基和试验菌液的准备均同前法。
涂抹试验菌液：斑点涂抹法将琼脂平板表面分为 4 等分或 6 等分，每等分可供涂抹一株细菌培养物，
每株培养物涂抹 3 个菌斑，外圈 2 个，内圈 1 个。棉签涂抹法可将试验菌液在琼脂平板上涂抹成带状，
每个平板约可涂抹 5 条菌带，置数分钟，待菌斑干燥。
依次滴加上述 3 种噬菌体。斑点涂抹法，一般可把 O-I 噬菌体滴加在内圈的菌斑上。带状涂抹法，
可将 O-I 噬菌体滴加在菌带的左边。待噬菌体液滴干燥后，翻转平板，在 36 ℃培养 5 h ~6 h，和 14 h ~24
h 各观察一次结果。按表 2 判定结果。
表 2 噬菌体试验简化诊断法
O-I E 多价 C 多价 判定结果
CL - - 沙门氏菌属
v CL v 大肠埃希氏菌
- - CL 弗劳地氏柠檬酸杆菌群
a
- - - 噬菌体不裂解培养物
注：CL 表示融合性裂解；– 表示不裂解；v 表示裂解或不裂解。
a 除表 1 的注中所述外，并含阴沟肠杆菌和少数大肠埃希氏菌。
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5.3 噬菌体不裂解培养物的补充生化试验
少数沙门氏菌培养物不被 O-I 噬菌体裂解，少数大肠埃希氏菌培养物不被相应噬菌体裂解，不被各
种噬菌体裂解的培养物接种三糖铁琼脂，按 GB 4789.4 做 5 项生化试验，血清学分型鉴定后判定结果。
5.4 血清学分型鉴定及其他补充试验
5.4.1 沙门氏菌分型鉴定
按 GB 4789.4 进行。如果判定为沙门氏菌时，应得出完整的血清学分型鉴定的结果。
5.4.2 致泻大肠埃希氏菌鉴定
5.4.2.1 按 GB 4789.6 和 GB 4789.36 进行。分离的菌株应该同时被同样的几个噬菌体裂解后，用大肠
埃希氏菌分型噬菌体试验，这些菌株应该具有相同的裂解模式，同时测定 1 RTD 噬菌体的裂解情况。
5.4.2.2 产肠毒素大肠埃希氏菌，应有肠毒素试验的证实。
5.4.2.3 侵袭性大肠埃希氏菌，典型的生化特性为：赖氨酸脱羧酶试验阴性、无动力、产气或不产气
（O124 血清型亦可以为有动力、不产气），靛基质试验阳性。可进一步做豚鼠角膜试验，结果应该为阳
性，质粒电泳应证明具有 120~140 Mdal 大质粒，PCR 试验证明具有 ipaC 或 ipaH 基因。
5.4.2.4 产志贺毒素大肠埃希氏菌 O157:H7，典型的生化特性为：乳糖、蔗糖产酸，葡萄糖产酸并多
数产气，硫化氢阴性，靛基质阳性，山梨醇迟缓发酵。PCR 试验证明具有产志贺毒素基因 stx1，stx2 和
溶血毒素基因 hly。1RTD 的 E-2 噬菌体裂解试验，能被 1RTD 的 E-2 噬菌体裂解（裂解程度包括从 CL
到少数几个噬斑）。对于产志贺毒素和溶血毒素其他血清型的大肠埃希氏菌，按照 5.4.2.3 的程序进行鉴
定。
5.4.2.5 肠道致病性大肠埃希氏菌 具有大肠埃希氏菌的典型生化特性，eae 基因（黏附屏蔽基因）的
PCR 试验为阳性。产志贺毒素大肠埃希氏菌 eae 试验也可为阳性。EAF（黏附因子质粒基因）或 bfp（菌
毛捆绑形成基因）的 PCR 试验可进一步证实。
5.4.3 志贺氏菌分型鉴定
5.4.3.1 挑取三糖铁琼脂上的培养物，按噬菌体裂解模式，选用相应的志贺氏菌分型因子血清，做玻片
凝集试验。血清学分型鉴定结果见表 3。
表 3 噬菌体试验的结果和志贺氏菌血清学分型鉴定的结果
序
号
噬菌体裂解模式
志贺氏菌血清学分型鉴定的结果
O-I C Sh E CE E-4 Ent
1 - - CL CL CL CL - 福氏 1-5,(鲍氏 11)
2 - - CL CL CL - - 福氏 1,4,痢疾 2,鲍氏 5,7,11,16,17,(宋内氏 I)
3 - - CL CL - - - 宋内氏 I,痢疾 2,福氏 4,鲍氏 5,16
4 - - CL CL - CL - 宋内氏 II,福氏 3
5 - - CL - - - - 福氏 6,鲍氏 1~4,偶数型 6~18(除 16 外),痢疾 3~12
6 - - CL - CL - - 鲍氏 9,15
7 - - CL - - CL - 痢疾 1,(宋内氏 II)
8 CL - CL - - - - 鲍氏 13 a
注：CL 表示融合性裂解；– 表示不裂解。
a 鲍氏 13 型 DNA 同源性测定不符合志贺氏菌。
5.4.3.2 如按噬菌体裂解模式结果为福氏志贺氏菌 1~5 型，先用福氏多价血清做凝集试验。如呈现凝
集，再分别用各型和群因子血清检查，以确定所属血清型和亚型（见 GB 4789.5）。
5.4.3.3 如按噬菌体裂解模式结果为福氏 6 型，鲍氏各型或痢疾 3~12 型，先用福氏 6 型血清做凝集试
GB 4789.31—2013
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验。福氏 6 型血清不凝集者，用鲍氏多价血清或痢疾 3~12 型多价血清做凝集试验，如果呈现凝集，再
分别用各型因子血清检查。
5.4.3.4 如按噬菌体裂解模式结果为宋内氏 II 相菌而不被宋内氏血清凝集时，可直接按噬菌体裂解模
式和粗糙型菌落特征判定之。
5.4.3.5 按噬菌体裂解模式结果做血清学试验不凝集者，或虽发现其被某一个分型因子血清凝集而与噬
菌体裂解模式不相符者，或虽与噬菌体裂解模式相符但不被 1 RTD 的 Sh 噬菌体裂解者，均应做葡萄糖
铵试验以与大肠埃希氏菌相鉴别。葡萄糖铵试验阳性者为大肠埃希氏菌。必要时可做如下生化试验：醋
酸盐、克氏柠檬酸盐和粘液酸的利用试验，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶试验，七叶苷分解试验。除宋内氏菌
鲍氏 13 型为鸟氨酸脱羧酶阳性，并有少数宋内氏菌菌株可利用黏液酸外，志贺氏菌属的培养物均为阴性
结果。上述试验任何阳性结果均提示为大肠埃希氏菌（按 GB 4789.5）。
5.4.3.6 检出的志贺氏菌培养物应符合该群的生化特性。福氏志贺氏菌 6 型符合鲍氏志贺氏菌的特性。
靛基质阳性的志贺氏菌血清型有痢疾 2 型、7 型和 8 型，鲍氏 5、7、9、11、13、15、16 和 17 型。福氏
志贺氏菌 1~5 型的靛基质反应较弱。靛基质阴性的志贺氏菌血清型为痢疾 1 型、3~6 型、9~12 型、福氏
6 型、鲍氏 1~4、6、8、10、12、14 和 18 型、宋内氏菌。
5.4.3.7 鲍氏志贺氏菌13型是唯一可被沙门氏菌O-I裂解的菌株，该菌株只被高效价的Sh噬菌体裂解。
5.5 结果报告
5.5.1 沙门氏菌检验的结果报告
5.5.1.1 O-I 噬菌体裂解，其他噬菌体均不裂解者，经沙门氏菌血清分型后报告。
5.5.1.2 各种噬菌体不裂解，生化试验结果为沙门氏菌，经沙门氏菌血清分型后报告，不可报告为未定
型。
5.5.2 志贺氏菌检验的结果报告
5.5.2.1 Sh 噬菌体裂解，呈现各种裂解模式，血清学试验与裂解模式相符者，可报告志贺氏菌血清型。
罕见血清型要求被 1 RTD Sh 噬菌体裂解，并符合志贺氏菌生化分群结果。
5.5.2.2 非如 5.5.2.1 的试验结果均报告非志贺氏菌。
5.5.3 致泻大肠埃希氏菌检验的结果报告
5.5.3.1 E 和或 Sh、E-4 噬菌体裂解，不同来源菌株的裂解模式具有同一性，或各种噬菌体均不裂解，
经血清学分型确定者可分别报告为产肠毒素大肠埃希氏菌（肠毒素试验结果阳性），侵袭性大肠埃希氏菌
（赖氨酸阴性、动力阴性，O124 可为动力阳性），产志贺毒素大肠埃希氏菌（O157: :H7 和 O157: :NM，
stx1, stx2, hly 试验阳性）或肠道致病性大肠埃希氏菌（eae 试验阳性）。
5.5.3.2 非如 5.5.3.1 的结果均报告为非大肠埃希氏菌或非致泻大肠埃希氏菌。
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附录 A
培养基及试剂
A.1 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液
A.1.1 成分
蛋白胨 5.0 g
乳糖 4.0 g
亚硒酸氢钠 4.0 g
1% L-胱氨酸溶液 1.0 mL
磷酸氢二钠（无水） 4.5 g
磷酸二氢钠（无水） 5.5 g
蒸馏水 加至1 000.0mL
A.1.2 制法
称取 L-胱氨酸 0.1 g（或 DL-胱氨酸 0.2 g），加入 1 mol/L 氢氧化钠溶液 1.5 mL，使胱氨酸溶解，再
加入蒸馏水 8.5 mL，即为 1% L-胱氨酸溶液。
将蛋白胨、乳糖、胱氨酸加入于蒸馏水 800 mL 中，为基础液。
将亚硒酸氢钠加入于 100 mL 蒸馏水中，为 A 液。
将磷酸氢二钠和磷酸二氢钠加入于 100 mL 蒸馏水中，为 B 液。
取基础液 4.0 mL，A 液 0.5 mL，B 液 0.5 mL 混合，测定 pH。校正 pH 至 7.0~7.1，将此 3 份溶液分
别包装，在 121℃高压灭菌 15 min（从高压灭菌器开始加热到取出不超过 1 h），待其冷却至常温后放入
5 ℃冰箱内保存。临用前将 3 份溶液按比例混合，分装试管。3 份溶液混合后，其 pH 值小于 7.0，则应
调整磷酸氢二钠、磷酸二氢钠的用量和亚硒酸氢钠的用量。使用前应测定其增菌灵敏度，方法见附录 B。
不同亚硒酸盐和磷酸盐的用量见表 A.1。
表 A.1 不同亚硒酸盐和磷酸盐的用量
亚硒酸盐的种类和用量
g
磷酸盐的种类和用量
g
主要种类 用量 NaH 2 PO 4 (无水) Na 2 HPO 4 (无水)
亚硒酸钠•H 2 O(100%) 5.0 8.6 0.8
亚硒酸钠•H 2 O (75%) 4.75 7.8 1.25
亚硒酸钠•H 2 O (50%) 4.5 7.0 2.65
亚硒酸氢钠(75%) 4.25 6.25 3.58
亚硒酸氢钠(100%) 4.0 5.5 4.5
亚硒酸氢钠(75%) 3.85 4.7 5.4
亚硒酸氢钠(50%) 3.7 3.9 6.35
亚硒酸(75%) 3.55 3.1 7.28
亚硒酸(100%) 3.4 2.3 8.2
注：表中所列均为在 1000mL 增菌液中的用量。
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A.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液
A.2.1 成分
A.2.1.1 基础液
多价胨或初蛋白胨 3.0 g
胆盐 1.0 g
碳酸钙 10.0 g
硫代硫酸钠 30.0 g
0.1%煌绿水溶液 10.0 mL
蒸馏水 加至1 000.0 mL
A.2.1.2 碘液
碘 6.0 g
碘化钾 5.0 g
蒸馏水 20.0 mL
A.2.2 制法
A.2.2.1 基础液的配制：将基础液的成分依次加到 800mL 蒸馏水中，成分溶解后加蒸馏水至 1000mL，
校正 pH 至 7.00.1，经高压灭菌 121℃，15 min。冷却后保存备用。
A.2.2.2 碘液的配制：先将碘化钾溶解于蒸馏水中，再加入碘片，振摇至碘片完全溶解。贮于棕色瓶内，
密塞备用。临用前将基础液与碘液混合，分装试管。使用前应测定其增菌灵敏度，方法见附录 B。
注：为了防止变形杆菌的过度生长，可以在 1000 mL 中加入磺胺噻脞 1.25 mg。
A.3 志贺氏菌（BCT）增菌液
A.3.1 成分
蛋白胨 20.0 g
复合氨基酸 2.0 g
牛肉膏 5.0 g
三号胆盐 4.5 g
柠檬酸钠 4.5 g
硫代硫酸钠 4.5 g
蒸馏水 加至1 000.0 mL
A.3.2 制法
将 A.3.1 成分混合加热溶解，冷却至 25℃校正 pH 至 7.20.1，高压灭菌 121℃，15 min，冷却后分
装试管备用。
A.4 营养肉汤（NB）
GB 4789.31—2013
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A.4.1 成分
蛋白胨 15.0 g
牛肉膏 3.0 g
氯化钠 5.0 g
蒸馏水 加至1 000.0 mL
A.4.2 制法
将 A.4.1 成分混合加热溶解，冷却至 25℃校正 pH 至 7.20.2，高压灭菌 121 ℃，15 min，备用。
A.5 营养琼脂（NA）
成分和制法：在 1000 mL 营养肉汤（NB）内加入琼脂 15 g（如用作噬菌体试验，只加琼脂 10 g），
高压灭菌 120 ℃，15 min，备用。
A.6 营养半固体琼脂（NSA）
成分和制法：在 1000 mL 营养肉汤（NB）内加入琼脂 3 g，高压灭菌 120 ℃，15 min，备用。
A.7 三糖铁琼脂（TSI）
A.7.1 成分
蛋白胨 20.0 g
牛肉膏 3.0 g
乳 糖 10.0 g
蔗 糖 10.0 g
葡萄糖 1.0 g
硫酸亚铁铵（含6个结晶水） 0.5 g
酚红 0.025 g或5 g／L溶液5 mL
氯化钠 5.0 g
硫代硫酸钠 0.5 g
琼 脂 12.0 g
蒸馏水 加至1 000.0 mL
A.7.2 制法
除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，搅拌均匀，静置约 10 min，加热煮沸至完全
溶解，校正 pH 至 7.4±0.1。另将琼脂加入 600 mL 蒸馏水中，搅拌均匀，静置约 10 min，加热煮沸至完
全溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入酚红指示剂，混匀，分装试管（12 mm×100 mm），每管约 2
mL～4 mL，高压灭菌 120℃ 10 min 或 115℃ 15 min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。
A.8 葡萄糖铵琼脂
A.8.1 成分
GB 4789.31—2013
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氯化钠 5.0 g
MgSO 4 ·7H 2 O 0.2 g
NH 4 H 2 PO 4 1.0 g
磷酸氢二钾（无水） 1.0 g
葡萄糖 5.0 g
琼脂 20.0 g
0.2%溴麝香草酚蓝 40.0 mL
蒸馏水 加至 1 000.0 mL
A.8.2 制法
将 A.8.1 成分混合加热溶解，冷却至 25℃校正 pH 至 6.80.1，高压灭菌 121℃，15 min，放置成斜
面，冷却后备用。
A.8.3 试验方法
用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不到混浊，以每一接种环
内含菌数在20 CFU~100 CFU之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接种普通斜面一支
作为对照。于36 ℃1 ℃培养24 h。阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的菌落生长；阴性者不生长，但
在对照培养基上生长良好。如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。
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14
附录 B
增菌液灵敏度测定方法
B.1 沙门氏菌增菌液灵敏度测定方法
B.1.1 试验菌株为沙门氏菌鼠伤寒血清型，沙门氏菌肠炎血清型。
B.1.2 干扰菌株为大肠埃希氏菌。
B.1.3 将试验菌株和干扰菌株接种营养肉汤管，在 36 ℃1 ℃培养 18 h~24 h。菌液浓度约为
10 9 CFU/mL。大肠埃希氏菌菌液浓度不需测定，应测定沙门氏菌鼠伤寒血清型和肠炎血清型的菌液浓度。
B.1.4 每组 8 支 15 mm150 mm 试管，编号，单号试管内每管加入灭菌生理盐水 4.5 mL，双号试管内
每管加入灭菌生理盐水 5.0 mL。
B.1.5 在 1 号管内加入沙门氏菌营养肉汤培养液 0.5 mL，在 2 号管内加入沙门氏菌培养液 0.05 mL。再
从 2 号管内吸取沙门氏菌稀释菌液，加入到 3 号管内 0.5 mL，加入到 4 号管内 0.05 mL。按此法继续稀
释到 8 号管。每次稀释应更换一支吸管。
B.1.6 吸取 6 号管内的稀释菌液各 0.1 mL，分别点加在 2 个营养琼脂平板上，用弯曲的接种环将菌液
均匀涂布，待平板表面的菌液干燥后，于 36 ℃1 ℃培养 14 h~24 h。计算平板上生长的沙门氏菌菌落
数，取其平均数，约为 100 CFU。
B.1.7 接 B.1.5，排好若干组每组 10 支需要测定的增菌液，第 8 管到第 10 管都加入 8 号稀释管的稀释
菌液各 0.1 mL；第 7 管到第 1 管逆序加入该稀释度的稀释菌液各 0.1 mL。
B.1.8 逆序向每管内加入未稀释的大肠埃希氏菌菌液 0.1 mL。振摇各管，使加入的菌液混合均匀。在
36 ℃1 ℃培养 18 h~24 h。
B.1.9 振摇各管，使培养物混合均匀。挑取培养物，划线接种到鉴别培养基上，使能够出现单个菌落。
在 36 ℃1 ℃培养 18 h~24 h。
B.1.10 观察在鉴别培养基上沙门氏菌和大肠埃希氏菌菌落的生长情况。按照表 B.1 记录增菌培养的结
果。
表 B.1 增菌培养的结果
增菌培养的结果 记录
沙门氏菌菌落数在 90%以上，大肠埃希氏菌的菌落少见 ++++
沙门氏菌菌落数约占 80% +++
沙门氏菌和大肠埃希氏菌的菌落数分别占 50% ++
平板上大肠埃希氏菌的菌落为主，可见少数几个沙门氏菌的菌落 +
平板上生长的是大肠埃希氏菌的菌落，未见沙门氏菌的菌落 -
注：判定增菌液的灵敏度，是以++++和+++的结果为准。8~10 号管 3 管中有 1 管或 1 管以上达到++++，或+++的增菌效果，
就可以判定已经达到这一管的灵敏度（约 1 CFU ）。++和+的结果可检出，也可能被疏忽。
B.2 沙门氏菌增菌液灵敏度简易测定方法
B.2.1 用于核对已经过测定的增菌液的灵敏度。
B.2.2 试验菌株、干扰菌株，及将菌株接种到营养肉汤和培养的方法均同 B.1.1~B.1.3.。
B.2.3 准备 15 mm150 mm 灭菌试管 2 支，分别加入灭菌生理盐水 5 mL。用直径为 3 mm 的接种环挑
取试验菌株的营养肉汤培养物 1 满环（5 L），稀释到 5 mL 生理盐水中，此时相当于 1∶10 3 稀释。再
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挑取此稀释液 1 满环，稀释到另一支 5 mL 生理盐水管中，此时相当于 1:10 6 稀释。吸取此稀释液 0.1 mL，
涂布接种于一个营养琼脂平板上，用于菌落计数，菌落数约为 80 CFU ~100 CFU。再将此稀释液做成 1:10
和 1:100 稀释。
B.2.4 在 2~4 支增菌液管内，各加入未稀释的大肠埃希氏菌肉汤培养物 0.1 mL，再在其中一管内加入
1:10 稀释的试验菌液（B.2.3）0.1 mL，另外的 1~3 支增菌液管内各加入 1:100 稀释的试验菌液（B.2.3）
0.1 mL，将试管内液体振摇使其均匀。在 36 ℃1 ℃培养 14 h~24 h。划线接种鉴别培养基，在 36 ℃1 ℃
培养 14 h~24 h 后观察结果。接种 1:10 稀释的试验菌液（B.2.3）的管相当于 B.1 试验方法中的第 7 管，
后面各管相当于第 8 管～第 10 管。
B.3 志贺氏菌增菌液灵敏度测定方法
B.3.1 试验菌株 福氏志贺氏菌 2a 型，鲍氏志贺氏菌 4 型，痢疾志贺氏菌 2 型，宋内氏志贺氏菌各 1
株。
B.3.2 干扰菌株 大肠埃希氏菌 10 株。
B.3.3 对比增菌液，以 GN 肉汤作为对比增菌液，以判定所测定的增菌液是否优于 GN 肉汤。
