GB/T 4789.34-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验

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中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
GB4789. 34 — 2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验 双歧杆菌检验
2016-12-23 发布 2017-06-23 实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局
发 布
GB4789. 34 — 2016
Ⅰ
前 言
本标准代替 GB4789. 34 — 2012 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定》。
本标准与 GB4789.
34 — 2012 相比,主要变化如下:
———增加了双歧杆菌的计数方法;
———增加了 MRS 培养基;
———修改了标准的适用范围;
———修改了附录 B 为可选项。
GB4789. 34 — 2016
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食品安全国家标准
食品微生物学检验 双歧杆菌检验
1  范围
本标准规定了双歧杆菌(
Bifidobacterium )的鉴定及计数方法。
本标准适用于双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数。本标准适用于食品中仅含有单一双歧杆菌的菌种
鉴定。本标准适用于食品中仅含有双歧杆菌属的计数,即食品中可包含一个或多个不同的双歧杆菌
菌种。
2  设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2. 1  恒温培养箱: 36℃±1℃ 。
2. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
2. 3  天平:感量 0. 01g 。
2. 4  无菌试管: 18mm×180mm 、 15mm×100mm 。
2. 5  无菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)或微量移液器( 200 μ L~1000 μ L )及
配套吸头。
2. 6  无菌培养皿:直径 90mm 。
3  培养基和试剂
3. 1  双歧杆菌培养基:见 A. 1 。
3. 2 PYG 培养基:见 A. 2 。
3. 3 MRS 培养基:见 A. 3 。
3. 4  甲醇:分析纯。
3. 5  三氯甲烷:分析纯。
3. 6  硫酸:分析纯。
3. 7  冰乙酸:分析纯。
3. 8  乳酸:分析纯。
4  检验程序
双歧杆菌的检验程序见图 1 。
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图 1  双歧杆菌的检验程序
5  操作步骤
5. 1  无菌要求
全部操作过程均应遵循无菌操作程序。
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5. 2  双歧杆菌的鉴定
5. 2. 1  纯菌菌种
5. 2. 1. 1  样品处理:半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板或 MRS 琼脂平板。固体菌种或
真空冷冻干燥菌种,可先加适量灭菌生理盐水或其他适宜稀释液,溶解菌粉。
5. 2. 1. 2  接种:接种于双歧杆菌琼脂平板或 MRS 琼脂平板。 36℃±1℃ 厌氧培养 48h±2h ,可延长至
72h±2h 。
5. 2. 2  食品样品
5. 2. 2. 1  样品处理:取样 25. 0g ( mL ),置于装有 225.0mL 生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内,于
8000r / min~10000r / min 均质 1min~2min ,或用拍击式均质器拍打 1min~2min ,制成 1∶10 的
样品匀液。冷冻样品可先使其在 2℃~5℃ 条件下解冻,时间不超过 18h ;也可在温度不超过 45℃ 的
条件解冻,时间不超过 15min 。
5. 2. 2. 2  接种或涂布:将上述样品匀液接种在双歧杆菌琼脂平板或 MRS 琼脂平板,或取 0. 1mL 适当
稀释度的样品匀液均匀涂布在双歧杆菌琼脂平板或 MRS 琼脂平板。 36℃±1℃ 厌氧培养 48h±2h ,
可延长至 72h±2h 。
5. 2. 2. 3  纯培养:挑取 3 个或以上的单个菌落接种于双歧杆菌琼脂平板或 MRS 琼脂平板。 36 ℃±
1℃ 厌氧培养 48h±2h ,可延长至 72h±2h 。
5. 2. 3  菌种鉴定
5. 2. 3. 1  涂片镜检:挑取双歧杆菌平板或 MRS 平板上生长的双歧杆菌单个菌落进行染色。双歧杆菌
为革兰氏染色阳性,呈短杆状、纤细杆状或球形,可形成各种分支或分叉等多形态,不抗酸,无芽孢,无
动力。
5. 2. 3. 2  生化鉴定:挑取双歧杆菌平板或 MRS 平板上生长的双歧杆菌单个菌落,进行生化反应检测。
过氧化氢酶试验为阴性。双歧杆菌的主要生化反应见表 1 。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生
化鉴定系统。
表 1  双歧杆菌菌种主要生化反应
编号 项目
两歧双歧杆菌
( B . bifidum )
婴儿双歧杆菌
( B .
infantis )
长双歧杆菌
( B .
longum )
青春双歧杆菌
( B .
adolescentis )
动物双歧杆菌
( B .
animalis )
短双歧杆菌
( B .
breve )
1 L- 阿拉伯糖 - - + + + -
2 D- 核糖 - + + + + +
3 D- 木糖 - + + d + +
4 L- 木糖 - - - - - -
5
阿东醇
- - - - - -
6 D- 半乳糖 d + + + d +
7 D- 葡萄糖 + + + + + +
8 D- 果糖 d + + d d +
9 D- 甘露糖 - + + - - -
10 L- 山梨糖 - - - - - -
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表 1 (续)
编号 项目
两歧双歧杆菌
( B . bifidum )
婴儿双歧杆菌
( B .
infantis )
长双歧杆菌
( B .
longum )
青春双歧杆菌
( B .
adolescentis )
动物双歧杆菌
( B .
animalis )
短双歧杆菌
( B .
breve )
11 L- 鼠李糖 - - - - - -
12
卫矛醇
- - - - - -
13
肌醇
- - - - - +
14
甘露醇
- - - - a - - a
15
山梨醇
- - - - a - - a
16
α- 甲 基 -D- 葡 萄
糖甙
- - + - - -
17
N - 乙 酰 - 葡 萄
糖胺
- - - - - +
18
苦杏仁甙(扁桃
甙)
- - - + + -
19
七叶灵
- - + + + -
20
水杨甙(柳醇)
- + - + + -
21 D- 纤维二糖 - + - d - -
22 D- 麦芽糖 - + + + + +
23 D- 乳糖 + + + + + +
24 D- 蜜二糖 - + + + + +
25 D- 蔗糖 - + + + + +
26 D- 海藻糖(覃糖) - - - - - -
27
菊糖(菊根粉)
- - a - - a - - a
28 D- 松三糖 - - + + - -
29 D- 棉籽糖 - + + + + +
30
淀粉
- - - + - -
31
肝糖(糖原)
- - - - - -
32
龙胆二糖
- + - + + +
33
葡萄糖酸钠
- - - + - -
注: + 表示 90% 以上菌株阳性; - 表示 90% 以上菌株阴性; d 表示 11%~89% 以上菌株阳性;
a
表示某些菌株阳性。
5. 2. 3. 3  有机酸测定:测定双歧杆菌的有机酸代谢产物(可选项),见附录 B 。
5. 3  双歧杆菌的计数
5. 3. 1  纯菌菌种
5. 3. 1. 1  固体和半固体样品的制备:以无菌操作称取 2.
0g
样品,置于盛有 198.
0mL 稀释液的无菌均质
杯内,
8000r / min~10000r / min 均质 1min~2min ,或置于盛有 198. 0mL 稀释液的无菌均质袋中,用
拍击式均质器拍打 1min~2min ,制成 1∶100 的样品匀液。
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5
5. 3. 1. 2  液体样品的制备:以无菌操作量取 1. 0mL 样品,置于 9. 0mL 稀释液中,混匀,制成 1∶10 的样
品匀液。
5. 3. 2  食品样品
5. 3. 2. 1  样品处理:取样 25. 0g ( mL ),置于装有 225.0mL 生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内,于
8000r / min~10000r / min 均质 1min~2min ,或用拍击式均质器拍打 1min~2min ,制成 1∶10 的
样品匀液。冷冻样品可先使其在 2℃~5℃ 条件下解冻,时间不超过 18h ;也可在温度不超过 45℃ 的
条件解冻,时间不超过 15min 。
5. 3. 3  系列稀释及培养
用 1mL 无菌吸管或微量移液器,制备 10 倍系列稀释样品匀液,于 8000r / min~10000r / min 均
质 1min~2min ,或用拍击式均质器拍打 1min~2min 。每递增稀释一次,即换用 1 次 1mL 灭菌吸管
或吸头。根据对样品浓度的估计,选择 2 个 ~3 个适宜稀释度的样品匀液,在进行 10 倍递增稀释时,吸
取 1.
0mL 样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取 1. 0mL 空白稀释液加入
两个无菌平皿内作空白对照。及时将 15mL~20mL 冷却至 46 ℃ 的双歧杆菌琼脂培养基或 MRS 琼
脂培养基(可放置于 46℃±1℃ 恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。从样品稀释
到平板倾注要求在 15min 内完成。待琼脂凝固后,将平板翻转,
36℃±1℃ 厌氧培养 48h±2h ,可延
长至 72h±2h 。培养后计数平板上的所有菌落数。
5. 3. 4  菌落计数
5. 3. 4. 1  可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以
菌落形成单位(
colony-formingunits , CFU )表示。
5. 3. 4. 2  选取菌落数在 30CFU~300CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30CFU
的平板记录具体菌落数,大于 300CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的
平均数。
5. 3. 4. 3  其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释
度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以
2 ,代表一个平板菌落数。
5. 3. 4. 4  当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
5. 3. 5  结果的表述
5. 3. 5. 1  若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平
均值乘以相应稀释倍数,作为每克或每毫升中菌落总数结果。
5. 3. 5. 2  若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式( 1 )计算:
N =
􀰑 C
(
n 1 +0. 1 n 2 ) d
…………………………( 1 )
式中:
N
———样品中菌落数;
􀰑 C ———平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;
n 1
———第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;
n 2
———第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;
d
———稀释因子(第一稀释度)。
5. 3. 5. 3  若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300CFU ,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可
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记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
5. 3. 5. 4  若所有稀释度的平板菌落数均小于 30CFU ,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数
计算。
5. 3. 5. 5  若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。
5. 3. 5. 6  若所有稀释度的平板菌落数均不在 30CFU~300CFU 之间,其中一部分小于 30CFU 或大于
300CFU 时,则以最接近 30CFU 或 300CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
5. 3. 6  菌落数的报告
5. 3. 6. 1  菌落数小于 100CFU 时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。
5. 3. 6. 2  菌落数大于或等于 100CFU 时,第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前 2 位数字,后面
用 0 代替位数;也可用 10 的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。
5. 3. 6. 3  称重取样以 CFU / g 为单位报告,体积取样以 CFU / mL 为单位报告。
5. 4  结果与报告
根据 5.
2. 3. 1 、 5. 2. 3. 2 , 5. 2. 3. 3 结果,报告双歧杆菌属的种名。根据 5. 3. 6 菌落计数结果出具报告,报
告单位以 CFU / g ( mL )表示。
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附 录 A
培养基和试剂
A. 1  双歧杆菌琼脂培养基
A. 1. 1  成分
蛋白胨 15.
0g
酵母浸膏
2. 0g
葡萄糖
20. 0g
可溶性淀粉
0. 5g
氯化钠
5. 0g
西红柿浸出液
400. 0mL
吐温 80
1. 0mL
肝粉
0. 3g
琼脂粉
20. 0g
加蒸馏水至
1000. 0mL
A. 1. 2  制法
A. 1. 2. 1  半胱氨酸盐溶液的配制:称取半胱氨酸 0. 5g ,加入 1. 0mL 盐酸,使半胱氨酸全部溶解,配制成
半胱氨酸盐溶液。
A. 1. 2. 2  西红柿浸出液的制备:将新鲜的西红柿洗净后称重切碎,加等量的蒸馏水在 100 ℃ 水浴中加
热,搅拌 90min ,然后用纱布过滤,校正 pH7.0±0.1 ,将浸出液分装后, 121 ℃ 高压灭菌 15 min~
20min 。
A. 1. 2. 3  制法:将 A. 1. 1 所有成分加入蒸馏水中,加热溶解,然后加入半胱氨酸盐溶液,校正
pH
至 6.
8
±0. 1 。分装后 121℃ 高压灭菌 15min~20min 。
A. 2 PYG 液体培养基
A. 2. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
葡萄糖
2. 5g
酵母粉
5. 0g
半胱氨酸 -HCl
0. 25g
盐溶液
20. 0mL
维生素 K 1 溶液
0. 5mL
氯化血红素溶液 5mg / mL 2.
5mL
加蒸馏水至
500. 0mL
A. 2. 2  制法
A. 2. 2. 1  盐溶液的配制:称取无水氯化钙 0. 2g ,硫酸镁 0. 2g ,磷酸氢二钾 1. 0g ,磷酸二氢钾 1. 0g ,碳酸
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氢钠 10.
0g ,氯化钠 2.
0g ,加蒸馏水至 1000mL 。
A. 2. 2. 2  氯化血红素溶液( 5mg / mL )的配制:称取氯化血红素 0. 5g 溶于 1mol
/ L 氢氧化钠 1.
0mL
中,加蒸馏水至 100mL ,
121℃ 高压灭菌 15min~20min 。
A. 2. 2. 3  维生素 K 1 溶液的配制:称取维生素 K 1 1. 0g ,加无水乙醇 99. 0mL ,过滤除菌,避光冷藏保存。
A. 2. 2. 4  制法:除氯化血红素溶液和维生素 K 1 溶液外, A. 2. 1 其余成分加入蒸馏水中,加热溶解,校正
pH
至 6.
0±0. 1 ,加入中性红溶液。分装后 121℃ 高压灭菌 15min~20min 。临用时加热熔化琼脂,加
入氯化血红素溶液和维生素 K 1 溶液,冷至 50℃ 使用。
A. 3 MRS 培养基
A. 3. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
牛肉粉
5. 0g
酵母粉
4. 0g
葡萄糖
20. 0g
吐温 80
1. 0mL
K 2 HPO 4 · 7H 2 O 2. 0g
醋酸钠· 3H 2 O
5. 0g
柠檬酸三铵
2. 0g
MgSO 4 · 7H 2 O 0. 2g
MnSO 4 · 4H 2 O 0. 05g
琼脂粉
15. 0g
加蒸馏水至
1000. 0mL
A. 3. 2  制法
将 A.
3. 1 所有成分加入蒸馏水中,加热溶解,调节
pH
至 6.
2±0. 1 ,分装后 121℃ 高压灭菌 15min~
20min 。
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附 录 B
双歧杆菌的有机酸代谢产物检测方法
B. 1  双歧杆菌培养液制备
挑取双歧杆菌琼脂平板或 MRS 琼脂平板上纯培养的双歧杆菌接种于 PYG 液体培养基,同时用未
接种菌的 PYG 液体培养基做空白对照,厌氧,
36℃±1℃ 培养 48h 。
B. 2  标准液的配制
B. 2. 1  乙酸标准溶液:准确吸取分析纯冰乙酸 5. 7mL ,加水稀释至 100. 0mL ,摇匀,进行标定,配成约
1. 0mol
/ L 的乙酸标准溶液。标定方法为:准确称取乙酸 3.
0g ,加水 15.
0mL ,酚酞指示液 2 滴,用
1. 0mol
/ mL 氢氧化钠溶液滴定,并将滴定结果用空白试验校正。 1.
0mL1mol
/ mL 氢氧化钠溶液相当
于 60.
05mg 的乙酸。
B. 2. 2  乙酸使用液:将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至 20. 0mmol
/ L 。
B. 2. 3  乳酸标准溶液:吸取分析纯乳酸 8.4 mL ,加水稀释至 100.0 mL ,摇匀,进行标定,配成约
1. 0mol
/ L 的乳酸标准溶液。标定方法为:准确称取乳酸 1.
0g ,加水 50.
0mL ,加入 1mol
/ mL 氢氧化
钠滴定液 25.
0mL ,煮沸 5min ,加入酚酞指示液 2 滴,同时用 0. 5mol
/ mL 硫酸滴定液滴定,并将滴定结
果用空白试验校正。 1.
0mL1mol
/ mL 氢氧化钠溶液相当于 90.
08mg 的乳酸。
B. 2. 4  乳酸使用液:将乳酸标准溶液用水稀释至 20. 0mmol
/ L 。
B. 3  方法
B. 3. 1  乙酸的处理
取双歧杆菌培养液 2.
0mL~3. 0mL 放入 10mL 离心管中,加入 0. 2mL50% 硫酸溶液(体积分
数),混匀,加入 2.
0mL 丙酮,混匀后加过量氯化钠,剧烈振摇 1min ,再加入 2. 0mL 乙醚,振摇 1min
后,于 3000r / min 离心 5min ,将上清液转入另一试管中,下层溶液用 2.
0mL 丙酮和 2. 0mL 乙醚重复
提取 2 次,合并有机相,于 40℃ 水浴中用氮气吹至尽干,用 20mmol / L 的磷酸二氢钠溶液(
pH2. 0 ) - 乙
腈(
99+1 )溶解并定容至 1. 0mL ,混匀后备用。同样操作步骤处理乙酸标准和空白培养液。
B. 3. 2  乳酸的处理
取双歧杆菌培养液 2.
0mL~3. 0mL 放入 10mL 比色管中, 100℃ 水浴 10min ,加入 0. 2mL50%
(体积分数)硫酸溶液,混匀,加入 1.0 mL 甲醇,于 58 ℃ 水浴 30 min 后加水 1.0 mL ,加三氯甲烷
1. 0mL ,振摇 3min , 3000r / min 离心 5min ,取三氯甲烷层分析。同样操作步骤处理乳酸标准和空白
培养液。
B. 3. 3  液相色谱条件
色谱柱:
ZorbaxSb-Aq 液相色谱柱( 4.
6×150mm , 5 μ m )或其他等效色谱柱;流动相: 20mmol
/ L
的磷酸二氢钠溶液(
pH2. 0 ) - 乙腈( 99+1 ),等度洗脱,流速 1mL / min ;柱温箱:
35 ℃ ;紫外检测波长:
210nm ;外标定量。
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B. 4  结果计算
X = A
样 - A 空
A 标 × c
…………………………( B.
1 )
式中:
X
———样品培养液中乙酸或乳酸的含量,单位为微摩尔每毫升(
μ mol
/ mL );
A 样 ———样品培养液中乙酸或乳酸的峰面积;
A 空 ———空白培养液中乙酸或乳酸的峰面积;
A 标 ———乙酸标准或乳酸标准的峰面积;
c
———乙酸标准或乳酸标准的浓度,单位为微摩尔每毫升(
μ mol
/ mL )。
B. 5  允许差
相对相差 ≤15% 。
B. 6  结果判定
如果乙酸(
μ mol
/ mL )与乳酸(
μ mol
/ mL )比值大于 1 ,可判定为是双歧杆菌的有机酸代谢产物。