GB/T 4789.35-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验

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中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
GB4789. 35 — 2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验 乳酸菌检验
2016-12-23 发布 2017-06-23 实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局
发 布
GB4789. 35 — 2016
Ⅰ
前 言
本 标 准 代 替 GB4789.35 — 2010 《食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 微 生 物 学 检 验 乳 酸 菌 检 验》、
SN / T1941. 1 — 2007 《进出口食品中乳酸菌检验方法 第 1 部分:分离与计数方法》。
本标准与 GB4789.
35 — 2010 相比,主要变化如下:
———增加了乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明;
———修改了改良 MRS 培养基成分;
———修改了平板计数的接种方法和接种量。
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食品安全国家标准
食品微生物学检验 乳酸菌检验
1  范围
本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌(
lacticacidbacteria )的检验方法。
本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。
2  术语和定义
2. 1
乳酸菌 lacticacidbacteria
一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属(
Lactobacillus )、双
歧杆菌属(
Bifidobacterium )和嗜热链球菌属( Streptococcus )。
3  设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
3. 1  恒温培养箱: 36℃±1℃ 。
3. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
3. 3  均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。
3. 4  天平:感量 0. 01g 。
3. 5  无菌试管: 18mm×180mm 、 15mm×100mm 。
3. 6  无菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)或微量移液器及吸头。
3. 7  无菌锥形瓶: 500mL 、 250mL 。
4  培养基和试剂
4. 1  生理盐水:见 A. 1 。
4. 2 MRS ( ManRogosaSharpe )培养基及莫匹罗星锂盐( Li-Mupirocin )和半胱氨酸盐酸盐( Cysteine
Hydrochloride )改良 MRS 培养基:见 A. 2 和 A. 3 。
4. 3 MC 培养基( ModifiedChalmers 培养基):见 A. 4 。
4. 4 0. 5% 蔗糖发酵管:见 A. 5 。
4. 4 0. 5% 纤维二糖发酵管:见 A. 5 。
4. 6 0. 5% 麦芽糖发酵管:见 A. 5 。
4. 7 0. 5% 甘露醇发酵管:见 A. 5 。
4. 8 0. 5% 水杨苷发酵管:见 A. 5 。
4. 9 0. 5% 山梨醇发酵管:见 A. 5 。
4. 10 0. 5% 乳糖发酵管:见 A. 5 。
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4. 11  七叶苷发酵管:见 A. 6 。
4. 12  革兰氏染色液:见 A. 7 。
4. 13  莫匹罗星锂盐( Li-Mupirocin ):化学纯。
4. 14  半胱氨酸盐酸盐( CysteineHydrochloride ):纯度 >99% 。
5  检验程序
乳酸菌检验程序见图 1 。
图 1  乳酸菌检验程序图
6  操作步骤
6. 1  样品制备
6. 1. 1  样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
6. 1. 2  冷冻样品可先使其在 2℃~5℃ 条件下解冻,时间不超过 18h ,也可在温度不超过 45℃ 的条件
解冻,时间不超过 15min 。
6. 1. 3  固体和半固体食品:以无菌操作称取 25g 样品,置于装有 225mL 生理盐水的无菌均质杯内,于
8000r / min~10000r / min 均质 1min~2min ,制成 1∶10 样品匀液;或置于 225mL 生理盐水的无菌
均质袋中,用拍击式均质器拍打 1min~2min 制成 1∶10 的样品匀液。
6. 1. 4  液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品 25mL 放入装有 225mL 生理盐
水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇,制成 1∶10 的样品匀液。
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6. 2  步骤
6. 2. 1  用 1mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1∶10 样品匀液 1mL ,沿管壁缓慢注于装有 9mL 生理盐
水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均
匀,制成 1∶100 的样品匀液。
6. 2. 2  另取 1mL 无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做 10 倍递增样品匀液,每递增稀释
一次,即换用 1 次 1mL 灭菌吸管或吸头。
6. 2. 3  乳酸菌计数
6. 2. 3. 1  乳酸菌总数
乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明见表 1 。
表 1  乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明
样品中所包括乳酸菌菌属 培养条件的选择及结果说明
仅包括双歧杆菌属 按 GB4789.
34 的规定执行
仅包括乳杆菌属 按照 6.
2. 3. 4 操作。结果即为乳杆菌属总数
仅包括嗜热链球菌 按照 6.
2. 3. 3 操作。结果即为嗜热链球菌总数
同时包括双歧杆菌属和乳杆菌属
1 ) 按照 6. 2. 3. 4 操作。结果即为乳酸菌总数;
2 ) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照 6. 2. 3. 2 操作
同时包括双歧杆菌属和嗜热链球菌
1 ) 按照 6. 2. 3. 2 和 6. 2. 3. 3 操作,二者结果之和即为乳酸菌总数;
2 ) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照 6. 2. 3. 2 操作
同时包括乳杆菌属和嗜热链球菌
1 ) 按照 6. 2. 3. 3 和 6. 2. 3. 4 操作,二者结果之和即为乳酸菌总数;
2 ) 6. 2. 3. 3 结果为嗜热链球菌总数;
3 ) 6. 2. 3. 4 结果为乳杆菌属总数
同时包括 双歧 杆菌 属,乳 杆菌 属和 嗜 热链
球菌
1 ) 按照 6. 2. 3. 3 和 6. 2. 3. 4 操作,二者结果之和即为乳酸菌总数;
2 ) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照 6. 2. 3. 2 操作
6. 2. 3. 2  双歧杆菌计数
根据对待检样品双歧杆菌含量的估计,选择 2 个 ~3 个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取 1mL
样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后,将冷却至 48℃ 的莫匹罗星锂盐
和半胱氨酸盐酸盐改良的 MRS 培养基倾注入平皿约 15mL ,转动平皿使混合均匀。 36 ℃±1 ℃ 厌氧
培养 72h±2h ,培养后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在 15min 内完成。
6. 2. 3. 3  嗜热链球菌计数
根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计,选择 2 个 ~3 个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取
1mL 样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后,将冷却至 48℃ 的 MC 培
养基倾注入平皿约 15mL ,转动平皿使混合均匀。 36℃±1℃ 需氧培养 72h±2h ,培养后计数。嗜热
链球菌在 MC 琼脂平板上的菌落特征为:菌落中等偏小,边缘整齐光滑的红色菌落,直径 2mm±1mm ,菌
落背面为粉红色。从样品稀释到平板倾注要求在 15min 内完成。
6. 2. 3. 4  乳杆菌计数
根据待检样品活菌总数的估计,选择 2 个 ~3 个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取 1mL 样品匀
液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后,将冷却至 48℃ 的 MRS 琼脂培养基倾
注入平皿约 15mL ,转动平皿使混合均匀。 36℃±1℃ 厌氧培养 72h±2h 。从样品稀释到平板倾注要
求在 15min 内完成。
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6. 3  菌落计数
注:可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位
(
colony-formingunits , CFU )表示。
6. 3. 1  选取菌落数在 30CFU~300CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30CFU
的平板记录具体菌落数,大于 300CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的
平均数。
6. 3. 2  其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释
度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以
2 ,代表一个平板菌落数。
6. 3. 3  当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
6. 4  结果的表述
6. 4. 1  若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平
均值乘以相应稀释倍数,作为每克或每毫升中菌落总数结果。
6. 4. 2  若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式( 1 )计算:
N =
∑ C
(
n 1 +0. 1 n 2 ) d
……………………………( 1 )
式中:
N ———样品中菌落数;
∑ C ———平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;
n 1
———第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;
n 2
———第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;
d
———稀释因子(第一稀释度)。
6. 4. 3  若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300CFU ,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可
记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
6. 4. 4  若所有稀释度的平板菌落数均小于 30CFU ,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数
计算。
6. 4. 5  若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。
6. 4. 6  若所有稀释度的平板菌落数均不在 30CFU~300CFU 之间,其中一部分小于 30CFU 或大于
300CFU 时,则以最接近 30CFU 或 300CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
6. 5  菌落数的报告
6. 5. 1  菌落数小于 100CFU 时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。
6. 5. 2  菌落数大于或等于 100CFU 时,第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前 2 位数字,后面用
0 代替位数;也可用 10 的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。
6. 5. 3  称重取样以 CFU / g 为单位报告,体积取样以 CFU / mL 为单位报告。
7  结果与报告
根据菌落计数结果出具报告,报告单位以 CFU / g ( mL )表示。
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8  乳酸菌的鉴定(可选做)
8. 1  纯培养
挑取 3 个或以上单个菌落,嗜热链球菌接种于 MC 琼脂平板,乳杆菌属接种于 MRS 琼脂平板,置
36℃±1℃ 厌氧培养 48h 。
8. 2  鉴定
8. 2. 1  双歧杆菌的鉴定按 GB4789. 34 的规定操作。
8. 2. 2  涂片镜检:乳杆菌属菌体形态多样,呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞,革兰氏染色阳性。
嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状,直径为 0.
5 μ m~2. 0 μ m ,成对或成链排列,无芽胞,革兰氏染色阳性。
8. 2. 3  乳酸菌菌种主要生化反应见表 2 和表 3 。
表 2  常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应
菌种 七叶苷 纤维二糖 麦芽糖 甘露醇 水杨苷 山梨醇 蔗糖 棉子糖
干酪乳 杆 菌 干 酪 亚 种 ( L .
casei subsp.
casei )
+ + + + + + + -
德氏乳杆菌保加利亚种( L .
delbrueckii
subsp. bulgaricus )
- - - - - - - -
嗜酸乳杆菌( L .
acidophilus ) + + + - + - + d
罗伊氏乳杆菌( L .
reuteri ) ND - + - - - + +
鼠李糖乳杆菌( L .
rhamnosus ) + + + + + + + -
植物乳杆菌( L .
plantarum )
+ + + + + + + +
注: + 表示 90% 以上菌株阳性; - 表示 90% 以上菌株阴性; d 表示 11%~89% 菌株阳性; ND 表示未测定。
表 3  嗜热链球菌的主要生化反应
菌种 菊糖 乳糖 甘露醇 水杨苷 山梨醇 马尿酸 七叶苷
嗜热链球菌(
S . thermophilus ) - + - - - - -
注: + 表示 90% 以上菌株阳性; - 表示 90% 以上菌株阴性。
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附 录 A
培养基及试剂
A. 1  生理盐水
A. 1. 1  成分
NaCl 8. 5g
A. 1. 2  制法
将上述成分加入到 1000mL 蒸馏水中,加热溶解,分装后 121℃ 高压灭菌 15min~20min 。
A. 2 MRS 培养基
A. 2. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
牛肉粉
5. 0g
酵母粉
4. 0g
葡萄糖
20. 0g
吐温 80
1. 0mL
K 2 HPO 4 · 7H 2 O 2. 0g
醋酸钠· 3H 2 O
5. 0g
柠檬酸三铵
2. 0g
MgSO 4 · 7H 2 O 0. 2g
MnSO 4 · 4H 2 O 0. 05g
琼脂粉
15. 0g
A. 2. 2  制法
将上述成分加入到 1000mL 蒸馏水中,加热溶解,调节
pH
至 6.
2±0. 2 ,分装后 121 ℃ 高压灭菌
15min~20min 。
A. 3  莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良 MRS 培养基
A. 3. 1  莫匹罗星锂盐储备液制备:称取 50mg 莫匹罗星锂盐加入到 50mL 蒸馏水中,用 0. 22 μ m 微孔
滤膜过滤除菌。
A. 3. 2  半胱氨酸盐酸盐储备液制备:称取 250mg 半胱氨酸盐酸盐加入到 50mL 蒸馏水中,用 0. 22 μ m 微
孔滤膜过滤除菌。
A. 3. 3  制法
将 A.
2. 1 成分加入到 950mL 蒸馏水中,加热溶解,调节
pH
,分装后 121℃ 高压灭菌 15min~20min 。
临用时加热熔化琼脂,在水浴中冷至 48℃ ,用带有 0.
22 μ m 微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐储备液
及半胱氨酸盐酸盐储备液制备加入到熔化琼脂中,使培养基中莫匹罗星锂盐的浓度为 50 μ g / mL ,半胱
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氨酸盐酸盐的浓度为 500 μ g / mL 。
A. 4 MC 培养基
A. 4. 1  成分
大豆蛋白胨
5. 0g
牛肉粉
3. 0g
酵母粉
3. 0g
葡萄糖
20. 0g
乳糖
20. 0g
碳酸钙
10. 0g
琼脂
15. 0g
蒸馏水
1000mL
1% 中性红溶液 5. 0mL
A. 4. 2  制法
将前面 7 种成分加入蒸馏水中,加热溶解,调节
pH
至 6.
0±0. 2 ,加入中性红溶液。分装后 121 ℃
高压灭菌 15min~20min 。
A. 5  乳酸杆菌糖发酵管
A. 5. 1  基础成分
牛肉膏
5. 0g
蛋白胨
5. 0g
酵母浸膏
5. 0g
吐温 80
0. 5mL
琼脂
1. 5g
1. 6% 溴甲酚紫酒精溶液 1. 4mL
蒸馏水
1000mL
A. 5. 2  制法
按 0.
5% 加入所需糖类,并分装小试管, 121℃ 高压灭菌 15min~20min 。
A. 6  七叶苷培养基
A. 6. 1  成分
蛋白胨
5. 0g
磷酸氢二钾
1. 0g
七叶苷
3. 0g
枸橼酸铁
0. 5g
1. 6% 溴甲酚紫酒精溶液 1. 4mL
蒸馏水
100mL
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A. 6. 2  制法
将上述成分加入蒸馏水中,加热溶解,
121℃ 高压灭菌 15min~20min 。
A. 7  革兰氏染色液
A. 7. 1  结晶紫染色液
A. 7. 1. 1  成分
结晶紫
1. 0g
95% 乙醇 20mL
1% 草酸铵水溶液 80mL
A. 7. 1. 2  制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
A. 7. 2  革兰氏碘液
A. 7. 2. 1  成分
碘
1. 0g
碘化钾
2. 0g
蒸馏水
300mL
A. 7. 2. 2  制法
将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至 300mL 。
A. 7. 3  沙黄复染液
A. 7. 3. 1  成分
沙黄
0. 25g
95% 乙醇 10mL
蒸馏水
90mL
A. 7. 3. 2  制法
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
A. 7. 4  染色法
A. 7. 4. 1  将涂片在酒精灯火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染 1min ,水洗。
A. 7. 4. 2  滴加革兰氏碘液,作用 1min ,水洗。
A. 7. 4. 3  滴加 95% 乙醇脱色,约 15s~30s ,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。
A. 7. 4. 4  滴加复染液,复染 1min 。水洗、待干、镜检。