GB/T 4789.36-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验

[所属分类:GB/T 4789] [发布时间:2019-8-9] [发布人:wwxa] [阅读次数:] [返回]

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
GB4789. 36 — 2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验
大肠埃希氏菌 O157 :
H7
/
NM
检验
2016-12-23 发布 2017-06-23 实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局
发 布
GB4789. 36 — 2016
Ⅰ
前 言
本标准代替 GB / T4789. 36 — 2008 《食品卫生微生物学检验 大肠埃希氏菌 O157 : H7 / NM 检验》。
本标准与 GB / T4789.
36 — 2008 相比,主要变化如下:
———标准名称修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌 O157 : H7 / NM 检验”;
———修改了标准的范围;
———修改了设备和材料;
———修改了培养基和生化反应的文字描述;
———删除“第二法 免疫磁珠捕获法的原理”;
———删除“第三法 全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法”;
———删除“第四法 全自动病原菌检测系统筛选法”。
GB4789. 36 — 2016
1
食品安全国家标准
食品微生物学检验
大肠埃希氏菌 O157 :
H7
/ NM 检验
1  范围
本标准规定了食品中大肠埃希氏菌 O157 : H7 / NM ( Escherichiacoli O157 : H7 / NM )的检验方法。
本标准适用于食品中大肠埃希氏菌 O157 : H7 / NM 的检验。
2  设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2. 1  恒温培养箱: 36℃±1℃ 。
2. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
2. 3  恒温水浴箱: 46℃±1℃ 。
2. 4  天平:感量 0. 1g 、 0. 01g 。
2. 5  均质器。
2. 6  显微镜: 10 倍 ~100 倍。
2. 7  无菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)或移液器及吸头。
2. 8  无菌均质杯或无菌均质袋:容量 500mL 。
2. 9  无菌培养皿:直径 90mm 。
2. 10 pH 计或精密
pH 试纸。
2. 11  长波紫外光灯: 365nm ,功率 ≤6W 。
2. 12  微量离心管: 1. 5mL 或 2. 0mL 。
2. 13  磁板、磁板架、样品混合器。
2. 14  微生物鉴定系统。
3  培养基和试剂
3. 1  改良 EC 肉汤( mEC+n ):见 A. 1 。
3. 2  改良山梨醇麦康凯琼脂( CT-SMAC ):见 A. 2 。
3. 3  三糖铁琼脂( TSI ):见 A. 3 。
3. 4  营养琼脂:见 A. 4 。
3. 5  半固体琼脂:见 A. 5 。
3. 6  月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 -MUG ( MUG-LST ):见 A. 6 。
3. 7  氧化酶试剂:见 A. 7 。
3. 8  革兰氏染色液:见 A. 8 。
3. 9 PBS-Tween20 洗液:见 A. 9 。
3. 10  亚碲酸钾( AR 级)。
GB4789. 36 — 2016
2
3. 11  头孢克肟( Cefixime )。
3. 12  大肠埃希氏菌 O157 显色培养基。
3. 13  大肠埃希氏菌 O157 和 H7 诊断血清或 O157 乳胶凝集试剂。
3. 14  鉴定试剂盒。
3. 15  抗 - E . coli O157 免疫磁珠。
第一法 常规培养法
4  检验程序
大肠埃希氏菌 O157 : H7 / NM 常规培养法检验程序见图 1 。
图 1  大肠埃希氏菌 O157 : H7 / NM 常规培养法检验程序
5  操作步骤
5. 1  增菌
以无菌操作取检样 25g (或 25mL )加入到含有 225mLmEC+n 肉汤的均质袋中,在拍击式均质
器上连续 均 质 1 min~2 min ;或 放 入 盛 有 225 mL mEC+n 肉 汤 的 均 质 杯 中, 8000r / min~
10000r / min 均质 1min~2min 。 36℃±1℃ 培养 18h~24h 。
GB4789. 36 — 2016
3
5. 2  分离
取增菌后的 mEC+n 肉汤,划线接种于 CT-SMAC 平板和大肠埃希氏菌 O157 显色琼脂平板上,
36℃±1℃ 培养 18h~24h ,观察菌落形态。在 CT-SMAC 平板上,典型菌落为圆形、光滑、较小的无色
菌落,中心呈现较暗的灰褐色;在大肠埃希氏菌 O157 显色琼脂平板上的菌落特征按产品说明书进行
判定。
5. 3  初步生化试验
在 CT-SMAC 和大肠埃希氏菌 O157 显色琼脂平板上分别挑取 5 个 ~10 个可疑菌落,分别接种
TSI 琼脂,同时接种 MUG-LST 肉汤,并用大肠埃希氏菌株( ATCC25922 或等效标准菌株)做阳性对照
和大肠埃希氏菌 O157 : H7 ( NCTC12900 或等效标准菌株)做阴性对照,于 36 ℃±1 ℃ 培养 18h~
24h 。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在 TSI 琼脂中,典型菌株为斜面与底层均呈黄色,产气或
不产气,不产生硫化氢( H 2 S )。置 MUG-LST 肉汤管于长波紫外灯下观察,
MUG 阳性的大肠埃希氏菌
株应有荧光产生, MUG 阴性的应无荧光产生,大肠埃希氏菌 O157 :
H7 / NM 为 MUG 试验阴性,无荧
光。挑取可疑菌落,在营养琼脂平板上分纯,于 36℃±1℃ 培养 18h~24h ,并进行下列鉴定。
5. 4  鉴定
5. 4. 1  血清学试验
在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落,用 O157 和 H7 诊断血清或 O157 乳胶凝集试剂作玻片凝集试
验。对于 H7 因子血清不凝集者,应穿刺接种半固体琼脂,检查动力,经连续传代 3 次,动力试验均阴
性,确定为无动力株。如使用不同公司生产的诊断血清或乳胶凝集试剂,应按照产品说明书进行。
5. 4. 2  生化试验
5. 4. 2. 1  自营养琼脂平板上挑取菌落,进行生化试验。大肠埃希氏菌 O157 : H7 / NM 生化反应特征见
表 1 。
表 1  大肠埃希氏菌 O157 : H7 / NM 生化反应特征
生化试验 特征反应
三糖铁琼脂 底层及斜面呈黄色, H 2 S 阴性
山梨醇 阴性或迟缓发酵
靛基质 阳性
甲基红 - 伏普试验( MR-VP )
MR 阳性, VP 阴性
氧化酶 阴性
西蒙氏柠檬酸盐 阴性
赖氨酸脱羧酶 阳性(紫色)
鸟氨酸脱羧酶 阳性(紫色)
纤维二糖发酵 阴性
棉子糖发酵 阳性
MUG 试验
阴性(无荧光)
动力试验 有动力或无动力
GB4789. 36 — 2016
4
5. 4. 2. 2  如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统,应从营养琼脂平板上挑取菌落,用稀释液制备成浊
度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。
5. 4. 3  毒力基因测定(可选项目)
样品中检出大肠埃希氏菌 O157 : H7 或 O157 : NM 时,如需要进一步检测 Vero 细胞毒素基因的存
在,可通过接种 Vero 细胞或 HeLa 细胞,观察细胞病变进行判定;也可使用基因探针检测或聚合酶链反
应(
PCR )方法进行志贺毒素基因( stx 1 、 stx 2 )、 eae 、
hly
等基因的检测。如使用试剂盒检测上述基因,应
按照产品的说明书进行。
6  结果报告
综合生化和血清学试验结果,报告 25g (或 25mL )样品中检出或未检出大肠埃希氏菌 O157 : H7
或大肠埃希氏菌 O157 : NM 。
第二法 免疫磁珠捕获法
7  检验程序
大肠埃希氏菌 O157 : H7 / NM 免疫磁珠捕获法检验程序见图 2 。
图 2  大肠埃希氏菌 O157 : H7 / NM 免疫磁珠捕获法检验程序
GB4789. 36 — 2016
5
8  操作步骤
8. 1  增菌
同 5.
1 。
8. 2  免疫磁珠捕获与分离
8. 2. 1  应按照生产商提供的使用说明进行免疫磁珠捕获与分离。当生产商的使用说明与下面的描述
可能有偏差时,按生产商提供的使用说明进行。
8. 2. 2  将微量离心管按样品和质控菌株进行编号,每个样品使用 1 只微量离心管,然后插入到磁板架
上。在漩涡混合器上轻轻振荡 E .
coli O157 免疫磁珠混悬液后,用开盖器打开每个微量离心管的盖子,
每管加入 20 μ L E . coli O157 免疫磁珠悬液。
8. 2. 3  取 mEC+n 肉汤增菌培养物 1mL ,加入到微量离心管中,盖上盖子,然后轻微振荡 10s 。每个
样品更换 1 只加样吸头,质控菌株必须与样品分开进行,避免交叉污染。
8. 2. 4  结合:在 18℃~30℃ 环境中,将上述微量离心管连同磁板架放在样品混合器上转动或用手轻微
转动 10min ,使 E . coli O157 与免疫磁珠充分接触。
8. 2. 5  捕获:将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠。在 3min 内不断地倾斜磁板架,确保悬液中与盖子上的
免疫磁珠全部被收集起来。此时,在微量离心管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。
8. 2. 6  吸取上清液:取 1 支无菌加长吸管,从免疫磁珠聚集物对侧深入液面,轻轻吸走上清液。当吸到
液面通过免疫磁珠聚集物时,应放慢速度,以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠,则
应将其放回到微量离心管中,并重复 8.
2. 5 步骤。每个样品换用 1 支无菌加长吸管。
免疫磁珠的滑落:某些样品特别是那些富含脂肪的样品,其磁珠聚集物易于滑落到管底。在吸取上
清液时,很难做到不丢失磁珠,在这种情况下,可保留 50 μ L~100 μ L 上清液于微量离心管中。如果在
后续的洗涤过程中也这样做的话,脂肪的影响将减小,也可达到充分捕获的目的。
8. 2. 7  洗涤:从磁板架上移走磁板,在每个微量离心管中加入 1mLPBS-Tween20 洗液,放在样品混合
器上转动或用手轻微转动 3min ,洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤 8.
2. 5~8. 2. 7 。
8. 2. 8  重复上述步骤 8. 2. 5~8. 2. 6 。
8. 2. 9  免疫磁珠悬浮:移走磁板,将免疫磁珠重新悬浮在 100 μ LPBS-Tween20 洗液中。
8. 2. 10  涂布平板:将免疫磁珠混匀,各取 50 μ L 免疫磁珠悬液分别转移至 CT-SMAC 平板和大肠埃希
氏菌 O157 显色琼脂平板一侧,然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半,再用接种环划线接种平
板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后,翻转平板,于 36℃±1℃ 培养 18h~24h 。
注:若 CT-SMAC 平板和大肠埃希氏菌 O157 显色琼脂平板表面水分过多时,应在 36 ℃±1 ℃ 下干燥 10min~
20min ,涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘。
8. 3  菌落识别
大肠埃希氏菌 O157 : H7 / NM 在 CT-SMAC 平板和大肠埃希氏菌 O157 显色琼脂平板上的菌落特
征同 5.
2 。
8. 4  初步生化试验
同 5.
3 。
8. 5  鉴定
同 5.
4 。
GB4789. 36 — 2016
6
9  结果报告
同第 6 章。
GB4789. 36 — 2016
7
附 录 A
培养基和试剂
A. 1  改良 EC 肉汤( mEC+n )
A. 1. 1  成分
胰蛋白胨
20. 0g
3 号胆盐 1. 12g
乳糖
5. 0g
K 2 HPO 4 · 7H 2 O 4. 0g
KH 2 PO 4 1. 5g
NaCl 5. 0g
新生霉素钠盐溶液(
20mg
/ mL )
1. 0mL
蒸馏水
1000mL
A. 1. 2  制法
除新生霉素外,所有成分溶解在水中,加热煮沸,在 20℃~25℃ 下校正
pH
至 6.
9±0. 1 ,分装。于
121℃ 高压灭菌 15min ,备用。制备浓度为 20mg / mL 的新生霉素储备溶液,过滤法除菌。待培养基温
度冷至 50℃ 以下时,按 1000mL 培养基内加 1mL 新生霉素储备液,使最终浓度为 20mg / L 。
A. 2  改良山梨醇麦康凯( CT-SMAC )琼脂
A. 2. 1  山梨醇麦康凯( SMAC )琼脂
A. 2. 1. 1  成分
蛋白胨
20. 0g
山梨醇
10. 0g
3 号胆盐 1. 5g
氯化钠
5. 0g
中性红
0. 03g
结晶紫
0. 001g
琼脂
15. 0g
蒸馏水
1000mL
A. 2. 1. 2  制法
除琼脂、结晶紫和中性红外,所有成分溶解在蒸馏水中,加热煮沸,在 20 ℃~25 ℃ 下校正
pH
至
7. 2±0. 2 ,加入琼脂、结晶紫和中性红,煮沸溶解,分装。于 121℃ 高压灭菌 15min 。
A. 2. 2  亚碲酸钾溶液
A. 2. 2. 1  成分
亚碲酸钾
0. 5g
GB4789. 36 — 2016
8
蒸馏水
200mL
A. 2. 2. 2  制法
将亚碲酸钾溶于水,过滤法除菌。
A. 2. 3  头孢克肟( Cefixime )溶液
A. 2. 3. 1  成分
头孢克肟
1. 0mg
95% 乙醇 200mL
A. 2. 3. 2  制法
将头孢克肟溶解于 95% 乙醇中,静置 1h 待其充分溶解后过滤除菌。分装试管,储存于 -20℃ ,有
效期 1 年。解冻后的头孢克肟溶液不应再冻存,且在 2℃~8℃ 下有效期 14d 。
A. 2. 4 CT-SMAC 制法
取 1000mL 灭菌融化并冷却至 46℃±1℃ 的山梨醇麦康凯( SMAC )琼脂,加入 1mL 亚碲酸钾溶
液和 10mL 头孢克肟溶液,使亚碲酸钾浓度达到 2.
5mg
/ L ,头孢克肟浓度达到 0.
05mg
/ L ,混匀后倾注
平板。
A. 3  三糖铁琼脂( TSI )
A. 3. 1  成分
蛋白胨
20. 0g
牛肉浸膏
5. 0g
乳糖
10. 0g
蔗糖
10. 0g
葡萄糖
1. 0g
硫酸亚铁铵[( NH 4 )
2 Fe ( SO 4 ) 2 · 6H 2 O ] 0. 2g
氯化钠
5. 0g
硫代硫酸钠
0. 2g
酚红
0. 025g 或 5. 0g / L 溶液 5. 0mL
琼脂
12. 0g
蒸馏水
1000mL
A. 3. 2  制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加于 400mL 蒸馏水中,煮沸溶解,在 20℃~25℃ 下校正
pH
至 7.
4
±0. 2 。另将琼脂加于 600mL 蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,加入 5% 酚红水溶液 5mL ,混匀,分装小号试管,每管约 2mL~4mL 。
于 121°C10min 或 115°C15min ,制成高层斜面。冷却后呈桔红色。如不立即使用,在 2℃~8℃ 条
件下可储存一个月。
GB4789. 36 — 2016
9
A. 4  营养琼脂
A. 4. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
牛肉膏
3. 0g
氯化钠
5. 0g
琼脂
15. 0g
蒸馏水
1000mL
A. 4. 2  制法
将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,校正
pH
至 7.
4±0. 2 ,分装。于 121 ℃ 高压灭菌
15min 。
A. 5  半固体琼脂
A. 5. 1  成分
蛋白胨
1. 0g
牛肉膏
0. 3g
氯化钠
0. 5g
琼脂
0. 3g~0. 4g
蒸馏水
100mL
A. 5. 2  制法
将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,校正
pH
至 7.
4±0. 2 ,分装小试管,于 121℃ 高压
灭菌 15min 。直立凝固备用。
A. 6  月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤 -MUG ( LST-MUG )
A. 6. 1  成分
胰蛋白胨
20. 0g
氯化钠
5. 0g
乳糖
5. 0g
磷酸氢二钾 ( K
2 HPO 4 ) 2. 75g
磷酸二氢钾( KH 2 PO 4 )
2. 75g
十二烷基硫酸钠
0. 1g
4- 甲基伞形酮 -
β -D- 葡萄糖醛酸苷( MUG )
0. 1g
蒸馏水
1000mL
A. 6. 2  制法
将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,于 20℃~25℃ 下校正
pH
至 6.
8±0. 2 ,分装到带
有倒管的试管中,每管 10mL ,于 121℃ 高压灭菌 15min 。
GB4789. 36 — 2016
10
A. 7  氧化酶试剂
A. 7. 1  成分
N , N '- 二甲基对苯二胺盐酸盐
或 N , N , N' , N '- 四甲基对苯二胺盐酸盐
1. 0g
蒸馏水
100mL
A. 7. 2  制法
少量新鲜配制,于冰箱内避光保存,在 7d 内使用。
A. 7. 3  试验方法
用无菌棉拭子取单个菌落,滴加氧化酶试剂,
10s 内呈现粉红或紫红色,即为氧化酶试验阳性。不
变色者为氧化酶试验阴性。
A. 8  革兰氏染色液
A. 8. 1  结晶紫染色液
A. 8. 1. 1  成分
结晶紫
1. 0g
95% 乙醇 20mL
1% 草酸铵水溶液 80mL
A. 8. 1. 2  制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
A. 8. 2  革兰氏碘液
A. 8. 2. 1  成分
碘
1. 0g
碘化钾
2. 0g
蒸馏水
300mL
A. 8. 2. 2  制法
将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至 300mL 。
A. 8. 3  沙黄复染液
A. 8. 3. 1  成分
沙黄
0. 25g
95% 乙醇 10. 0mL
蒸馏水
90. 0mL
GB4789. 36 — 2016
11
A. 8. 3. 2  制法
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
A. 8. 4  染色法
A. 8. 4. 1  涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染 1min ,水洗。
A. 8. 4. 2  滴加革兰氏碘液,作用 1min ,水洗。
A. 8. 4. 3  滴加 95% 乙醇脱色约 15s~30s ,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。
A. 8. 4. 4  滴加复染液,复染 1min ,水洗、待干、镜检。
A. 9 PBS-Tween20 洗液
按照商品用 E . coli O157 免疫磁珠的洗液配方进行制备,或按照下列配方制备。
A. 9. 1  成分
氯化钠
8. 0g
氯化钾
0. 2g
磷酸氢二钠( Na
2 HPO 4 1. 15g
磷酸二氢钾( KH 2 PO 4 )
0. 2g
Tween20 0. 5g
蒸馏水
1000mL
A. 9. 2  制法
将上述成分溶解于水中,于 20 ℃~25 ℃ 下校正
pH
至 7.
3±0. 2 ,分装锥形瓶。 121 ℃ 高压灭菌
15min ,备用。