GB/T 4789.39-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 粪大肠菌群计数

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中华人民共和国国家标准
GB 4789.39—2013
食品安全国家标准
食品微生物学检验 粪大肠菌群计数
2013-11-29 发布 2014-06-01 实施
GB 4789.39—2013
I
前 言
本标准代替GB/T 4789.39-2008《食品卫生微生物学检验 粪大肠菌群计数》。
本标准与GB/T 4789.39-2008相比，主要修改如下：
——修改了标准的中文名称；
——修改了操作步骤；
——增加了附录B。
GB 4789.39—2013
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食品安全国家标准
食品微生物学检验 粪大肠菌群计数
1 范围
本标准规定了食品中粪大肠菌群计数的方法。
本标准适用于各类食品中粪大肠菌群的计数。
2 术语和定义
2.1 粪大肠菌群
一群在44.5 ℃培养24h～48 h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌
群来自人和温血动物粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。
3 技术要求设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a) 恒温培养箱：36℃±1 ℃;
b) 冰箱：2 ℃～5 ℃;
c) 恒温水浴箱：44.5 ℃±0.2 ℃;
d) 天平：感量0.1 g;
e) 均质器;
f) 振荡器;
g) 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头;
h) 无菌锥形瓶：容量 500 mL;
i) 无菌培养皿：直径 90 mm;
j) pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。
4 培养基及试剂
4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录 A 中 A.1。
4.2 EC 肉汤（E.coli Broth）：见附录 A 中 A.2。
4.3 无菌生理盐水：见附录 A 中 A.3。
4.4 1mol/L NaOH：见附录 A 中 A.4。
4.5 1mol/L HCl：见附录 A 中 A.5。
5 检验程序
粪大肠菌群检验程序见图1。
GB 4789.39—2013
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图1 粪大肠菌群 MPN 计数法检验程序
6 操作步骤
6.1 样品的稀释
6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g样品，置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000
r/min～10 000 r/min 均质 1 min～2 min，制成1:10 样品匀液，或置 225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍打
式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 的样品匀液。
6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取样品 25 mL 置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶
内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
6.1.3 样品匀液的 pH 值应在 6.5～7.5 之间，必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。
6.1.4 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入盛有 9 mL 磷酸盐缓冲
液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌
吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。
6.1.5 根据对样品污染状况的估计，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次，换用 1 支 1
mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。
6.2 初发酵试验
检 样
25g(mL)样品+ 225mL 稀释液，均质
10 倍系列稀释
月桂基硫酸盐胰蛋白胨 (LST)肉汤
36℃±1℃48h±2h
不产气 产气
EC 肉汤
44.5℃±0.2℃24h±2h
不产气 产气
粪大肠菌群阴性管 粪大肠菌群阳性管
查 MPN 表
报告结果
GB 4789.39—2013
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每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月
桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1 mL（如接种量需要超过1mL，则用双料LST肉汤），36 ℃±1
℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h±2
h。记录在24 h和48 h内产气的LST肉汤管数。未产气者为粪大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。
如采用多个稀释度，最终确定最适的三个连续稀释度方法参见附录B。
6.3 复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于预先升温至44.5 ℃的EC肉汤管中。将所有
接种的EC肉汤管放入带盖的44.5 ℃±0.2 ℃恒温水浴箱内，培养24 h±2 h，水浴箱的水面应高于肉汤培养基
液面，记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群阳性，不产气为粪大肠菌群阴性。
定期以已知为44.5 ℃产气阳性的大肠杆菌和44.5 ℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性
和阴性对照。
6.4 粪大肠菌群 MPN 计数的报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查粪大肠菌群最可能数（MPN）检索表（见附录C），报告每g (mL)
粪大肠菌群的MPN值。
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附录A
培养基和试剂
A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤
A.1.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g
氯化钠 5.0 g
乳糖 5.0 g
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ） 2.75 g
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ） 2.75 g
月桂基硫酸钠 0.1 g
蒸馏水 1 000.0 mL
A.1.2 制法
将A.1.1 成分溶解于蒸馏水中，校正pH至6.8±0.2。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL，121 ℃
高压灭菌15min。
A.2 EC肉汤（E.coli Broth）
A.2.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g
3号胆盐或混合胆盐 1.5 g
乳糖 5.0 g
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ） 4.0 g
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ） 1.5 g
氯化钠 5.0 g
蒸馏水 1 000.0 mL
A.2.2 制法
将 A.2.1 成分溶解于蒸馏水中，校正 pH 至 6.9±0.1。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管 8 mL，121
℃高压灭菌15 min。
A.3 无菌生理盐水
A.3.1 成分
氯化钠 8.5 g
蒸馏水 1 000.0 mL
A.3.2 制法
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称取 8.5 g 氯化钠溶于 1000 mL 蒸馏水中，121℃高压灭菌 15 min。
A.4 1 mol/L NaOH
A.4.1 成分
NaOH 40.0 g
蒸馏水 1 000.0 mL
A.4.2 制法
称取40g 氢氧化钠溶于1000 mL蒸馏水中。
A.5 1 mol/L HCl
A.5.1 成分
盐酸 90.0 mL
蒸馏水 1 000.0 mL
A.5.2 制法
移取盐酸 90 mL，用蒸馏水稀释至 1000 mL。
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附录 B
确定最适的三个连续稀释度方法
在10 -1 ～10 -5 五个连续稀释度中确定最适的三个连续稀释度方法如下：
a）有一个以上的稀释度3管均为阳性。选择三管都是阳性结果的最高稀释度及其相连的两个更高稀
释度（见表B.1示例a、b，表中带下划线的数字对应的接种样品量为最终选取的最适稀释度，下
同）；在未选择的较高稀释度中还有阳性结果时，则顺次下移到下一个更高三个连续稀释度（见
表B.1示例c）；如果中间有某个稀释度没有阳性结果，但更高稀释度有阳性结果，则将此阳性结
果加到前一稀释度，进而确定三个连续稀释度（见表B.1示例d）；如果不能按照这个原则找到三
个合适的稀释度，则选择前一个较低的稀释度（见表B.1示例e）;
b）没有任何一个稀释度3管均为阳性。如果没有一个稀释度的3管均为阳性，则选择三个最低稀释度
（见表B.1示例f）；如果在更高的没有被选择的稀释度还有阳性结果，将此阳性结果加到选择的
最高稀释度，进而确定三个连续稀释度（见表B.1示例g）。MPN计算阳性结果的选择示例见表B.1。
表 B.1 关于 MPN 计算阳性结果的选择示例
示例编
号
接种样品量
mL
选择的三个连续稀释度阳性
管数
MPN/g(mL)
0.1g 0.01 g 0.001 g 0.0001 g 0.00001 g
a 3 3 1 0 0 3-1-0 430
b 2 3 1 0 0 3-1-0 430
c 3 2 2 1 0 2-2-1 280
d 3 2 2 0 1 2-2-1 280
e 3 3 3 3 2 3-3-2 110000
f 0 0 1 0 0 0-0-1 3
g 2 2 1 1 0 2-2-2 35
注：下划线表示应选择的连续稀释度。
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附录 C
粪大肠菌群最可能数（MPN）表
每g(mL)检样中粪大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表C.1。
表C.1 粪大肠菌群最可能数（MPN）检索表
阳性管数
MPN
95%置信区间 阳性管数
MPN
95%置信区间
0.1 0.01 0.001 下限 上限 0.1 0.01 0.001 下限 上限
0 0 0 <3.0 — 9.5 2 2 0 21 4.5 42
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000
2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 —
注 1：本表采用 3 个稀释度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和 0.001g(mL)]、每个稀释度接种 3 管。
注 2：表内所列检样量如改用 lg（mL）、0.1g(mL)和 0.01g(mL)时，表内数字应相应降低 10 倍；如改用 0.01g(mL)、
0.001g(mL)、0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增高 10 倍，其余类推。