GB/T 4789.40-2024 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验

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中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
GB4789. 40 — 2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验
克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验
2016-12-23 发布 2017-06-23 实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局
发 布
GB4789. 40 — 2016
Ⅰ
前 言
本标准代替 GB4789. 40 — 2010 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验》、
SN / T1632. 1 — 2013 《出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法 第 1 部分:分离与计数》。
本标准与 GB4789.
40 — 2010 相比,主要变化如下:
———标准名称 修改为 “食 品安全国 家标准 食品微生物 学检验 克罗诺杆菌 属 (阪崎 肠杆
菌)检验”;
———修改了可疑菌落的挑取数量。
GB4789. 40 — 2016
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食品安全国家标准
食品微生物学检验
克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验
1  范围
本标准规定了食品中克罗诺杆菌属(
Cronobacter )的检验方法。
本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中克罗诺杆菌属的检验。
2  设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2. 1  恒温培养箱: 25℃±1℃ , 36℃±1℃ , 44℃±0. 5℃ 。
2. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
2. 3  恒温水浴箱: 44℃±0. 5℃ 。
2. 4  天平:感量 0. 1g 。
2. 5  均质器。
2. 6  振荡器。
2. 7  无菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)或微量移液器及吸头。
2. 8  无菌锥形瓶:容量 100mL 、 200mL 、 2000mL 。
2. 9  无菌培养皿:直径 90mm 。
2. 10 pH 计或
pH
比色管或精密
pH 试纸。
2. 11  全自动微生物生化鉴定系统。
3  培养基和试剂
3. 1  缓冲蛋白胨水( bufferpeptonewater , BPW ):见 A. 1 。
3. 2  改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 - 万古霉素( modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycin
medium , mLST-Vm ):见 A. 2 。
3. 3  阪崎肠杆菌显色培养基。
3. 4  胰蛋白胨大豆琼脂( trypticasesoyagar , TSA ):见 A. 3 。
3. 5  生化鉴定试剂盒。
3. 6  氧化酶试剂:见 A. 4 。
3. 7 L- 赖氨酸脱羧酶培养基:见 A. 5 。
3. 8 L- 鸟氨酸脱羧酶培养基:见 A. 6 。
3. 9 L- 精氨酸双水解酶培养基:见 A. 7 。
3. 10  糖类发酵培养基:见 A. 8 。
3. 11  西蒙氏柠檬酸盐培养基:见 A. 9 。
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第一法 克罗诺杆菌属定性检验
4  检验程序
克罗诺杆菌属检验程序见图 1 。
图 1  克罗诺杆菌属检验程序
5  操作步骤
5. 1  前增菌和增菌
取检样 100g ( mL )置灭菌锥形瓶中,加入 900mL 已预热至 44℃ 的缓冲蛋白胨水,用手缓缓地摇
动至充分溶解,
36℃±1℃ 培养 18h±2h 。移取 1mL 转种于 10mLmLST-Vm 肉汤, 44℃±0. 5℃
培养 24h±2h 。
5. 2  分离
5. 2. 1  轻轻混匀 mLST-Vm 肉汤培养物,各取增菌培养物 1 环,分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色
培养基平板,显色培养基须符合 GB4789.
28 的要求, 36℃±1℃ 培养 24h±2h ,或按培养基要求条件
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培养。
5. 2. 2  挑取至少 5 个可疑菌落,不足 5 个时挑取全部可疑菌落,划线接种于 TSA 平板。 25℃±1℃ 培
养 48h±4h 。
5. 3  鉴定
自 TSA 平板上直接挑取黄色可疑菌落,进行生化鉴定。克罗诺杆菌属的主要生化特征见表 1 。可
选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。
表 1  克罗诺杆菌属的主要生化特征
生化试验 特 征
黄色素产生
+
氧化酶
-
L- 赖氨酸脱羧酶 -
L- 鸟氨酸脱羧酶
( + )
L- 精氨酸双水解酶 +
柠檬酸水解 ( + )
发酵
D- 山梨醇
L- 鼠李糖
D- 蔗糖
D- 蜜二糖
苦杏仁甙
( - )
+
+
+
+
注: +>99% 阳性; ->99% 阴性;( + ) 90%~99% 阳性;( - ) 90%~99% 阴性。
6  结果与报告
综合菌落形态和生化特征,报告每 100g ( mL )样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。
第二法 克罗诺杆菌属的计数
7  操作步骤
7. 1  样品的稀释
7. 1. 1  固体和半固体样品:无菌称取样品 100g 、 10g 、 1g 各三份,分别加入 900mL 、 90mL 、 9mL 已预
热至 44℃ 的 BPW ,轻轻振摇使充分溶解,制成 1∶10 样品匀液,置 36℃±1℃ 培养 18h±2h 。分别移
取 1mL 转种于 10mLmLST-Vm 肉汤,
44℃±0. 5℃ 培养 24h±2h 。
7. 1. 2  液体样品:以无菌吸管分别取样品 100mL 、 10mL 、 1mL 各三份,分别加入 900mL 、 90mL 、
9mL 已预热至 44℃ 的 BPW ,轻轻振摇使充分混匀,制成 1∶10 样品匀液,置 36℃±1℃ 培养 18h±
2h 。分别移取 1mL 转种于 10mLmLST-Vm 肉汤, 44℃±0. 5℃ 培养 24h±2h 。
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7. 2  分离、鉴定
同 5.
2 和 5. 3 。
8  结果与报告
综合菌落形态、生化特征,根据证实为克罗诺杆菌属的阳性管数,查 MPN 检索表,报告每 100g
( mL )样品中克罗诺杆菌属的 MPN 值(见表 B.
1 )。
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附 录 A
培养基和试剂
A. 1  缓冲蛋白胨水( BPW )
A. 1. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
氯化钠
5. 0g
磷酸氢二钠( Na
2 HPO 4 · 12H 2 O ) 9. 0g
磷酸二氢钾
1. 5g
蒸馏水
1000mL
A. 1. 2  制法
加热搅拌至溶解,调节
pH
至 7.
2±0. 2 , 121℃ 高压灭菌 15min 。
A. 2  改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 - 万古霉素( Modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium , mLST-Vm )
A. 2. 1  改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨( mLST )肉汤
A. 2. 1. 1  成分
氯化钠
34. 0g
胰蛋白胨
20. 0g
乳糖
5. 0g
磷酸二氢钾
2. 75g
磷酸氢二钾
2. 75g
十二烷基硫酸钠
0. 1g
蒸馏水
1000mL
A. 2. 1. 2  制法
加热搅拌至溶解,调节
pH
至 6.
8±0. 2 。分装每管 10mL , 121℃ 高压灭菌 15min 。
A. 2. 2  万古霉素溶液
A. 2. 2. 1  成分
万古霉素
10. 0mg
蒸馏水
10. 0mL
A. 2. 2. 2  制法
10. 0mg 万古霉素溶解于 10. 0mL 蒸馏水,过滤除菌。万古霉素溶液可以在 0℃~5℃ 保存 15d 。
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A. 2. 3  改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 - 万古霉素( Modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycin
medium , mLST-Vm )
每 10mLmLST 加入万古霉素溶液 0. 1mL ,混合液中万古霉素的终浓度为 10 μ g / mL 。
注: mLST-Vm 必须在 24h 之内使用。
A. 3  胰蛋白胨大豆琼脂( TSA )
A. 3. 1  成分
胰蛋白胨
15. 0g
植物蛋白胨
5. 0g
氯化钠
5. 0g
琼脂
15. 0g
蒸馏水
1000mL
A. 3. 2  制法
加热搅拌至溶解,煮沸 1min ,调节
pH
至 7.
3±0. 2 , 121℃ 高压 15min 。
A. 4  氧化酶试剂
A. 4. 1  成分
N , N , N' , N' - 四甲基对苯二胺盐酸盐 1. 0g
蒸馏水
100mL
A. 4. 2  制法
少量新鲜配制,于冰箱内避光保存,在 7d 之内使用。
A. 4. 3  试验方法
用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落,涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸
在 10s 中之内未变为紫红色、紫色或深蓝色,则为氧化酶试验阴性,否则即为氧化酶实验阳性。
注:实验中切勿使用镍/铬材料。
A. 5 L- 赖氨酸脱羧酶培养基
A. 5. 1  成分
L- 赖氨酸盐酸盐( L-lysinemonohydrochloride ) 5. 0g
酵母浸膏
3. 0g
葡萄糖
1. 0g
溴甲酚紫
0. 015g
蒸馏水
1000mL
A. 5. 2  制法
将各成分加热溶解,必要时调节
pH
至 6.
8±0. 2 。每管分装 5mL , 121℃ 高压 15min 。
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A. 5. 3  实验方法
挑取培养物接种于 L- 赖氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。 30℃±1℃ 培养 24h±
2h ,观察结果。 L- 赖氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色,空白对照管为紫色。
A. 6 L- 鸟氨酸脱羧酶培养基
A. 6. 1  成分
L- 鸟氨酸盐酸盐( L-ornithinemonohydrochloride ) 5. 0g
酵母浸膏
3. 0g
葡萄糖
1. 0g
溴甲酚紫
0. 015g
蒸馏水
1000mL
A. 6. 2  制法
将各成分加热溶解,必要时调节
pH
至 6.
8±0. 2 。每管分装 5mL 。 121℃ 高压 15min 。
A. 6. 3  实验方法
挑取培养物接种于 L- 鸟氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。 30℃±1℃ 培养 24h±
2h ,观察结果。 L- 鸟氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色。
A. 7 L- 精氨酸双水解酶培养基
A. 7. 1  成分
L- 精氨酸盐酸盐( L-argininemonohydrochloride ) 5. 0g
酵母浸膏
3. 0g
葡萄糖
1. 0g
溴甲酚紫
0. 015g
蒸馏水
1000mL
A. 7. 2  制法
将各成分加热溶解,必要时调节
pH
至 6.
8±0. 2 。每管分装 5mL 。 121℃ 高压 15min 。
A. 7. 3  实验方法
挑取培养物接种于 L- 精氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。 30℃±1℃ 培养 24h±
2h ,观察结果。 L- 精氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色。
A. 8  糖类发酵培养基
A. 8. 1  基础培养基
A. 8. 1. 1  成分
酪蛋白(酶消化)
10. 0g
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8
氯化钠
5. 0g
酚红
0. 02g
蒸馏水
1000mL
A. 8. 1. 2  制法
将各成分加热溶解,必要时调节
pH
至 6.
8±0. 2 。每管分装 5mL 。 121℃ 高压 15min 。
A. 8. 2  糖类溶液( D- 山梨醇、 L- 鼠李糖、 D- 蔗糖、 D- 蜜二糖、苦杏仁甙)
A. 8. 2. 1  成分
糖
8. 0g
蒸馏水
100mL
A. 8. 2. 2  制法
分别称取 D- 山梨醇、 L- 鼠李糖、 D- 蔗糖、 D- 蜜二糖、苦杏仁甙等糖类成分各
8g ,溶于
100mL 蒸馏水
中,过滤除菌,制成 80mg / mL 的糖类溶液。
A. 8. 3  完全培养基
A. 8. 3. 1  成分
基础培养基
875mL
糖类溶液
125mL
A. 8. 3. 2  制法
无菌操作,将每种糖类溶液加入基础培养基,混匀;分装到无菌试管中,每管 10mL 。
A. 8. 4  实验方法
挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基,刚好在液体培养基的液面下。 30 ℃±1 ℃ 培养 24h±
2h ,观察结果。糖类发酵试验阳性者,培养基呈黄色,阴性者为红色。
A. 9  西蒙氏柠檬酸盐培养基
A. 9. 1  成分
柠檬酸钠
2. 0g
氯化钠
5. 0g
磷酸氢二钾
1. 0g
磷酸二氢铵
1. 0g
硫酸镁
0. 2g
溴麝香草酚蓝
0. 08g
琼脂
8. 0g~18. 0g
蒸馏水
1000mL
A. 9. 2  制法
将各成分加热溶解,必要时调节
pH
至 6.
8±0. 2 。每管分装 10mL , 121℃ 高压 15min ,制成斜面。
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A. 9. 3  实验方法
挑取培养物接种于整个培养基斜面,
36 ℃±1 ℃ 培养 24h±2h ,观察结果。阳性者培养基变为
蓝色。
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附 录 B
克罗诺杆菌属最可能数( MPN )检索表
每 100g ( mL )检样中克罗诺杆菌属最可能数( MPN )的检索见表 B.
1 。
表 B.
1  克罗诺杆菌属最可能数( MPN )检索表
阳性管数
100 10 1
MPN
95% 可信限
下限 上限
阳性管数
100 10 1
MPN
95% 可信限
下限 上限
0 0 0 <0. 3
—
0. 95 2 2 0 2. 1 0. 45 4. 2
0 0 1 0. 3 0. 015 0. 96 2 2 1 2. 8 0. 87 9. 4
0 1 0 0. 3 0. 015 1. 1 2 2 2 3. 5 0. 87 9. 4
0 1 1 0. 61 0. 12 1. 8 2 3 0 2. 9 0. 87 9. 4
0 2 0 0. 62 0. 12 1. 8 2 3 1 3. 6 0. 87 9. 4
0 3 0 0. 94 0. 36 3. 8 3 0 0 2. 3 0. 46 9. 4
1 0 0 0. 36 0. 017 1. 8 3 0 1 3. 8 0. 87 11
1 0 1 0. 72 0. 13 1. 8 3 0 2 6. 4 1. 7 18
1 0 2 1. 1 0. 36 3. 8 3 1 0 4. 3 0. 9 18
1 1 0 0. 74 0. 13 2 3 1 1 7. 5 1. 7 20
1 1 1 1. 1 0. 36 3. 8 3 1 2 12 3. 7 42
1 2 0 1. 1 0. 36 4. 2 3 1 3 16 4 42
1 2 1 1. 5 0. 45 4. 2 3 2 0 9. 3 1. 8 42
1 3 0 1. 6 0. 45 4. 2 3 2 1 15 3. 7 42
2 0 0 0. 92 0. 14 3. 8 3 2 2 21 4 43
2 0 1 1. 4 0. 36 4. 2 3 2 3 29 9 100
2 0 2 2 0. 45 4. 2 3 3 0 24 4. 2 100
2 1 0 1. 5 0. 37 4. 2 3 3 1 46 9 200
2 1 1 2 0. 45 4. 2 3 3 2 110 18 410
2 1 2 2. 7 0. 87 9. 4 3 3 3 >110 42
—
注 1 :本表采用 3 个检样量[ 100g ( mL )、 10g ( mL )和 1g ( mL )],每个检样量接种 3 管。
注 2 :表内所列检样量如改用 1000g ( mL )、 100g ( mL )和 10g ( mL )时,表内数字应相应降低 10 倍;如改用 10g
( mL )、
1g ( mL )和 0.
1g ( mL )时,则表内数字应相应增高 10
倍,其余类推。