GB/T 4789.41-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
GB4789. 41 — 2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验 肠杆菌科检验
2016-08-31 发布 2017-03-01 实施
中 华 人 民 共 和 国
国家卫生和计划生育委员会
发 布
GB4789. 41 — 2016
1
食品安全国家标准
食品微生物学检验 肠杆菌科检验
1  范围
本标准规定了食品中肠杆菌科(
Enterobacteriaceae )的检验方法。
本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计数;第二法适用于肠杆菌科含量较
低食品中肠杆菌科的计数。
2  术语和定义
2. 1
肠杆菌科 Enterobacteriaceae
在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2. 2
肠杆菌科计数 EnumerationofEnterobacteriaceae
按本标准规定方法,对每克或每毫升检样中的肠杆菌科进行计数。
2. 3
最可能数 mostprobablenumber ; MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
3  设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
3. 1  恒温培养箱: 36℃±1℃ 。
3. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
3. 3  水浴箱: 46℃±1℃ 。
3. 4  天平:感量 0. 1g 。
3. 5  显微镜: 10 倍 ~100 倍。
3. 6  均质器。
3. 7  振荡器。
3. 8  无菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)或微量移液器及吸头。
3. 9  无菌锥形瓶或等效容器:容量 150mL 、 500mL 。
3. 10  无菌培养皿:直径 90mm 。
3. 11  无菌试管: 18mm×180mm 、 15mm×150mm 。
3. 12 pH 计或
pH
比色管或精密
pH 试纸。
4  培养基和试剂
4. 1  缓冲蛋白胨水( BPW ):见 B. 1 。
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2
4. 2  缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤( EE 肉汤):见 B. 2 。
4. 3  结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂( VRBGA ):见 B. 3 。
4. 4  营养琼脂( NA ):见 B. 4 。
4. 5  葡萄糖琼脂:见 B. 5 。
4. 6  革兰氏染色液:见 B. 6 。
4. 7  氧化酶试剂:见 B. 7 。
4. 8  无菌 1mol
/ LNaOH :见 B.
8 。
4. 9  无菌 1mol
/ LHCl :见 B.
9 。
第一法 肠杆菌科平板计数法
5  检验程序
肠杆菌科平板计数法检验程序见图 1 。
图 1  肠杆菌科平板计数法检验程序
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3
6  操作步骤
6. 1  样品的稀释
6. 1. 1  固体和半固体样品:称取 25g 样品放入盛有 225mLBPW 的无菌均质杯中, 8000r
/ min~
10000r
/ min 均质 1min~2min ,或放入盛有 225 mLBPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打
1min~2min ,制成 1∶10 的样品匀液。
6. 1. 2  液体样品:以无菌吸管吸取 25mL 样品放入盛有 225mLBPW 的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数
量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成 1∶10 的样品匀液。
6. 1. 3  用 1mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1∶10 样品匀液 1mL ,沿管壁缓缓注入盛有 9mLBPW 的
无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面),振摇试管或换用 1 支 1mL 无菌吸管反复吹打,
使其混合均匀,制成 1∶100 的样品匀液。
6. 1. 4  按 6. 1. 3 操作程序,依次制成 10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次,换用 1 支 1mL 无
菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过 15min 。
6. 2  倾注平板和培养
6. 2. 1  根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择 2 个 ~3 个适宜的连续稀释度的样品匀液(液
体样品可以选择原液),每个稀释度接种 2 个无菌平皿。同时,分别吸取 1mLBPW 加入两个无菌平皿
内作为空白对照。
6. 2. 2  将 10mL~15mL 冷却至 46℃ 的 VRBGA (可放置于 46℃±1℃ 恒温水浴箱中保温)倾注于每
个平皿中。小心旋转平皿,使样品匀液与培养基充分混匀。
6. 2. 3  待琼脂凝固后,倾注一薄层同样的培养基覆盖平板表层。防止蔓延生长并使菌落特征更为
明显。
6. 2. 4  待 VRBGA 平板上层琼脂凝固后翻转平板, 36℃±1℃ 培养 18h~24h 。
6. 3  典型菌落计数和确认
6. 3. 1  肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。选取典型菌落数在 15CFU~
150CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板,只计数典型菌落数。菌落计数以菌 落形成单位 ( colony-
formingunits , CFU )表示。
6. 3. 2  其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释
度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以
2 ,代表一个平板菌落数。
6. 3. 3  当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
6. 3. 4  从每个平板上至少挑取 5 个(小于 5 个全选)典型菌落进行确认;如果有不同形态的典型菌落,则
每种形态分别至少挑取 1 个菌落进行确认。
6. 3. 5  典型菌落的确认:
a ) 分别将所挑选的每一个菌落,划线于营养琼脂平板, 36℃±1℃ 培养 18h~24h ,挑取平板上
的菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验。
b ) 革兰氏染色镜检:肠杆菌科为革兰氏阴性杆菌,无芽孢,大小为( 0.3~1.0 )
μ m× (
1.0~
6. 0 )
μ m 。
c ) 氧化酶试验:用铂/铱接种环或玻璃棒(不要用镍铬接种环)挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂
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的滤纸上,滤纸的颜色在 10s 内变成蓝紫色,判为阳性反应。
d ) 葡萄糖发酵试验:用接种针挑取少许氧化酶阴性的同一个菌落,穿刺于葡萄糖琼脂内,于 36℃±
1℃ 培养 24h±2h ,若试管内的内容物变为黄色,判为阳性反应。
6. 4  结果的计算
6. 4. 1  一般原则
若有两个连续稀释度的平板典型菌落数在适宜计数范围内,按式(
1 )计算,示例见 A.1 、 A.2 、
A. 3 、 A. 4 。
N =
∑ a
(
n 1 +0. 1 n 2 ) d
…………………………( 1 )
式中:
N
———样品中肠杆菌科菌落数;
∑ a ———确证的肠杆菌科菌落数之和;
n 1 ———第一稀释度(低稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);
n 2 ———第二稀释度(高稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);
d
———稀释因子(第一稀释度)。
其中,
a 按式( 2 )计算:
a = b
A
× C
…………………………( 2 )
式中:
a ———确证的肠杆菌科菌落数;
b ———某一平板中 A 个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数, b ≤ A ;
A ———某一平板中用于确认试验的菌落数;
C ———某一平板中典型菌落总数。
6. 4. 2  低菌落数
若最低稀释度(包括液体样品原液)平板的典型菌落数均小于 15CFU ,具有确证的肠杆菌科菌落,
则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算。
若最低稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,或典型菌落数均小于 15CFU ,且无确证的
肠杆菌科菌落,则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。
6. 4. 3  特殊情况
第一稀释度平板上的典型菌落数均大于 150CFU ,且有确证的肠杆菌科菌落,以及第二稀释度平
板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在 15CFU~150CFU 之间,则以确证的菌落数乘以第一
稀释倍数计算,示例见 A.
5 。
若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在适宜计数范围内,且无确证的肠杆菌科菌落,则以小于 1
乘以最低稀释倍数计算。
7  报告
7. 1  菌落数小于 100 时,以整数报告。
7. 2  菌落数大于或等于 100 时,对第 3 位数字进行修约后,取前 2 位数字,后面用 0 代替位数;也可用
10 的指数形式来表示,采用两位有效数字。
7. 3  数字修约按“四舍五入”原则进行。
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5
7. 4  若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。
7. 5  若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。
7. 6  称重取样以 CFU / g 为单位报告,体积取样以 CFU / mL 为单位报告。
第二法 肠杆菌科 MPN 计数法
8  检验程序
肠杆菌科 MPN 计数法检验程序见图 2 。
图 2  肠杆菌科 MPN 计数法检验程序
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9  操作步骤
9. 1  样品的稀释
按 6.
1 进行。
9. 2  接种和培养
9. 2. 1  非选择性前增菌
根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择 3 个适宜连续稀释度的样品匀液,每个稀释度
3 管,共 9 管 BPW 于 36℃ ±1℃ 培养 18h±2h 。
9. 2. 2  选择性增菌
从 BPW 各培养管中,分别移取 1mL 培养物,接种于 10mL 的 EE 肉汤中,
36℃±1℃ 培养 24h±
2h 。
9. 2. 3  分离
用接种环从 EE 各肉汤管中分别取培养物 1 环,划线接种于 VRBGA 平板,
36℃±1℃ 培养 24h±
2h ,观察平板上有无典型菌落。
9. 3  典型菌落的确认
典型菌落确认见 6.
3 。
10  报告
肠杆菌科为革兰氏阴性无芽胞杆菌,发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性。只要有 1 个菌落确认为肠杆菌
科,其所代表的 EE 管即为肠杆菌科阳性,依据 EE 阳性管数查 MPN 表(见附录 C ),报告每克(毫升)样
品中肠杆菌科的 MPN 值。称重取样以 MPN / g 为单位报告,体积取样以 MPN / mL 为单位报告。
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7
附 录 A
结果计算示例
A. 1  两个连续稀释度均含适宜的典型菌落数平板,并含有已确证的肠杆菌科菌落,数据见表 A. 1 。
表 A.
1  肠杆菌科平板计数结果示例 1
稀释度
1∶100 (第一稀释度) 1∶1000 (第二稀释度)
典型菌落数/ CFU
126 145 20 24
用于确认试验的菌落数/ CFU
5 5 5 5
确证的菌落数/ CFU
4 5 4 3
a 4 / 5×126=101 5 / 5×145=145 4 / 5×20=16 3 / 5×24=14
N =
101+145+16+14
[
2+ ( 0. 1×2 )]
×10
-2 =
276
0. 022 =12545
上述数据按 7. 2 数字修约后,表示为 13000 或 1. 3×10
4 。
A. 2  两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,其中某一稀释度的一个平板菌落数不在适宜范围内,
或者两个稀释度各有一个平板菌落数不在适宜范围内,则相应的平板不作为计数平板,数据见表 A.
2 。
表 A.
2  肠杆菌科平板计数结果示例 2
稀释度
1∶100 (第一稀释度) 1∶1000 (第二稀释度)
典型菌落数/ CFU
126 118 20 10
用于确认试验的菌落数/ CFU
5 8 5
—
确证的菌落数/ CFU
4 5 4
—
a 4 / 5×126=101 5 / 8×118=74 4 / 5×20=16
—
N =
101+74+16
[
2+ ( 0. 1×1 )]
×10
-2 =
191
0. 021 =9095
上述数据按 7. 2 数字修约后,表示为 9100 或 9. 1×10
3 。
A. 3  两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,其中一个平板无已确证的肠杆菌科菌落,则相应的平
板不作为计数平板,数据见表 A.
3 。
表 A.
3  肠杆菌科平板计数结果示例 3
稀释度
1∶100 (第一稀释度) 1∶1000 (第二稀释度)
典型菌落数/ CFU
126 118 20 20
用于确认试验的菌落数/ CFU
5 6 5 5
确证的菌落数/ CFU
4 6 4 0
a 4 / 5×126=101 6 / 6×118=118 4 / 5×20=16 0
N =
101+118+16+0
[
2+ ( 0. 1×1 )]
×10
-2 =
235
0. 021 =11190
上述数据按 7. 2 数字修约后,表示为 11000 或 1. 1×10
4 。
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A. 4  两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,但无已确证的肠杆菌科菌落,则以小于 1 乘以最低稀
释倍数计算。
A. 5  第一稀释度平板上的菌落数超过 150CFU ,且有证实的肠杆菌科菌落,以及第二稀释度平板上无
确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在 15CFU~150CFU 之间,则以确证的菌落数乘以第一稀释倍
数计算,数据见表 A.
5 。
表 A.
5  肠杆菌科平板计数结果示例 5
稀释度
1∶100 (第一稀释度) 1∶1000 (第二稀释度)
典型菌落数/ CFU
220 198 23 17
用于确认试验的菌落数/ CFU
5 5 5 5
确证的菌落数/ CFU
4 3 0 0
a 4 / 5×220=176 3 / 5×198=119 0 0
N =
176+119
2
æ
è
ç
ö
ø
÷ ×10
2 =14750
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附 录 B
培养基和试剂
B. 1  缓冲蛋白胨水( BPW )
B. 1. 1  成分
蛋白胨 10.
0g
氯化钠
5. 0g
磷酸氢二钠
3. 5g
磷酸二氢钾
1. 5g
蒸馏水
1000. 0mL
B. 1. 2  制法
将 B.
1. 1 成分加热溶解,于 25℃ 时调节
pH
至 7.
2±0. 2 ,分装于 500mL 广口瓶中,每瓶 225mL ,
121℃ 高压灭菌 15min 。
B. 2  缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤( EE 肉汤)
B. 2. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
葡萄糖
5. 0g
磷酸氢二钠(无水)
6. 45g
磷酸二氢钾
2. 0g
牛胆盐
20. 0g
煌绿
0. 0135g
蒸馏水
1000. 0mL
B. 2. 2  制法
将 B.
2. 1 成分溶于水中,加热煮沸至完全溶解,加热不宜超过 30min ,迅速冷却培养基,于 25℃ 调
节
pH
至 7.
2±0. 2 ,分装于灭菌的 18mm×180mm 试管中,每管 10mL ,不需高压灭菌, 5℃±3℃ 可存
放一个月。
B. 3  结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂( VRBGA )
B. 3. 1  成分
蛋白胨
7. 0g
酵母浸膏
3. 0g
3 号胆盐 1. 5g
葡萄糖
10. 0g
氯化钠
5. 0g
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10
中性红
0. 03g (或 0. 6% 酒精溶液 5mL )
结晶紫
0. 002g (或 0. 1% 水溶液 2mL )
琼脂粉
10. 0g~12. 0g
蒸馏水
1000. 0mL
B. 3. 2  制法
将 B.
3. 1 成分溶于水中,加热煮沸至完全溶解, 25℃ 时调节
pH
至 7.
4±0. 2 ,分装于灭菌的锥形烧
瓶中,不需高压灭菌,用前制备。倾注平板,使用前干燥平板。未干燥的平板 5℃±3℃ 可存放两周。
B. 4  营养琼脂( NA )
B. 4. 1  成分
牛肉浸膏
3. 0g
蛋白胨
5. 0g
琼脂粉
10. 0g~12. 0g
蒸馏水
1000. 0mL
B. 4. 2  制法
将 B.
4. 1 成分溶于水中,加热煮沸, 25℃ 时调节
pH
至 7.
3±0. 2 , 121 ℃ 高压灭菌 15min 。倾注平
板,使用前干燥平板。未干燥的平板于 5℃±3℃ 可存放两周。
B. 5  葡萄糖琼脂
B. 5. 1  成分
胰蛋白胨
10. 0g
酵母浸膏
1. 5g
葡萄糖
10. 0g
氯化钠
5. 0g
溴甲酚紫
0. 015g (或 0. 4% 溴甲酚紫酒精溶液 3. 75mL )
琼脂粉
10. 0g~12. 0g
蒸馏水
1000. 0mL
B. 5. 2  制法
将 B.
5. 1 成分溶于水中,加热煮沸, 25℃ 时调节
pH
至 7.
0±0. 2 ,分装于 15mm×150mm 试管,每
管约 5mL ,
121℃ 高压灭菌 15min 后,试管垂直放置。于 5℃±3℃ 可存放 1 周。为去除培养基中的
氧气,使用前可将葡萄糖琼脂试管置于沸水浴中 15min ,然后迅速冷却,备用。
B. 6  革兰氏染色液
B. 6. 1  结晶紫染色液
B. 6. 1. 1  成分
结晶紫
1. 0g
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11
95% 乙醇 20. 0mL
1% 草酸铵水溶液 80. 0mL
B. 6. 1. 2  制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
B. 6. 2  革兰氏碘液
B. 6. 2. 1  成分
碘
1. 0g
碘化钾
2. 0g
蒸馏水
300. 0mL
B. 6. 2. 2  制法
将碘和碘化钾先行混合,加入少许蒸馏水充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至 300mL 。
B. 6. 3  沙黄复染液
B. 6. 3. 1  成分
沙黄
0. 25g
95% 乙醇 10. 0mL
蒸馏水
90. 0mL
B. 6. 3. 2  制法
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
B. 6. 4  染色方法
B. 6. 4. 1  将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染 1min ,水洗。
B. 6. 4. 2  滴加革兰氏碘液,作用 1min ,水洗。
B. 6. 4. 3  滴加 95% 乙醇脱色 15s~30s ,直至染色液被洗掉,但不要过分脱色、水洗。
B. 6. 4. 4  加沙黄复染液,复染 1min ,水洗、干燥、镜检。
B. 6. 4. 5  革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
B. 7  氧化酶试剂
B. 7. 1  成分
N , N , N' , N' - 四甲基对苯二胺盐酸盐 1. 0g
蒸馏水
100. 0mL
B. 7. 2  制法
将 B.
7. 1 成分溶解于冷水中,少量新鲜配制。
B. 7. 3  试验方法
用细玻璃棒或一次性接种针挑去单个菌落,涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸上。在 10s 内呈现粉红
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或紫红色,即为氧化酶试验阳性。不变色者为氧化酶试验阴性。
B. 8  无菌 1mol
/ LNaOH
B. 8. 1  成分
NaOH 40. 0g
蒸馏水
1000. 0mL
B. 8. 2  制法
称取 40g 氢氧化钠溶于 1000mL 蒸馏水中,
121℃ 高压灭菌 15min 。
B. 9  无菌 1mol
/ LHCl
B. 9. 1  成分
HCl 90. 0mL
蒸馏水
1000. 0mL
B. 9. 2  制法
移取浓盐酸 90mL ,用蒸馏水稀释至 1000mL ,
121℃ 高压灭菌 15min 。
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附 录 C
肠杆菌科最可能数( MPN )检索表
每克(毫升)检样中肠杆菌科最可能数( MPN )的检索见表 C. 1 。
表 C.
1  肠杆菌科最可能数( MPN )的检索表
阳性管数
0. 10 0. 01 0. 001
MPN
95% 置信区间
下限 上限
阳性管数
0. 10 0. 01 0. 001
MPN
95% 置信区间
下限 上限
0 0 0 <3. 0
—
9. 5 2 2 0 21 4. 5 42
0 0 1 3. 0 0. 15 9. 6 2 2 1 28 8. 7 94
0 1 0 3. 0 0. 15 11 2 2 2 35 8. 7 94
0 1 1 6. 1 1. 2 18 2 3 0 29 8. 7 94
0 2 0 6. 2 1. 2 18 2 3 1 36 8. 7 94
0 3 0 9. 4 3. 6 38 3 0 0 23 4. 6 94
1 0 0 3. 6 0. 17 18 3 0 1 38 8. 7 110
1 0 1 7. 2 1. 3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3. 6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7. 4 1. 3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3. 6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3. 6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4. 5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4. 5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9. 2 1. 4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3. 6 42 3 2 3 290 90 1000
2 0 2 20 4. 5 42 3 3 0 240 42 1000
2 1 0 15 3. 7 42 3 3 1 460 90 2000
2 1 1 20 4. 5 42 3 3 2 1100 180 4100
2 1 2 27 8. 7 94 3 3 3 >1100 420
—
注 1 :本表采用 3 个稀释度[ 0. 1g ( mL )、 0. 01g ( mL )和 0. 001g ( mL )],每个稀释度接种 3 管。
注 2 :表内所列检样量如改用 1g ( mL )、 0.
1g ( mL )和 0.
01g ( mL )时,表内数字应相应降低 10 倍;如改用 0.
01g
( mL )、
0. 001g ( mL )、 0. 0001g ( mL )时,则表内数字应相应增高 10 倍,其余类推。