GB/T 4789.43-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 微生物源酶制剂抗菌活性的测定

[所属分类:GB/T 4789] [发布时间:2019-8-9] [发布人:wwxa] [阅读次数:] [返回]

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
GB4789. 43 — 2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验
微生物源酶制剂抗菌活性的测定
2016-12-23 发布 2017-06-23 实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局
发 布
GB4789. 43 — 2016
1
食品安全国家标准
食品微生物学检验
微生物源酶制剂抗菌活性的测定
1  范围
本标准规定了微生物源酶制剂抗菌活性的测定方法。
本标准适用于用微生物生产的酶制剂抗菌活性的测定。
2  设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2. 1  生物安全柜。
2. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
2. 3  恒温培养箱: 36℃±1℃ 。
2. 4  恒温水浴箱: 46℃±1℃ 。
2. 5  天平:感量为 0. 1g 。
2. 6  振荡器。
2. 7  无菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)或微量移液器及吸头。
2. 8  无菌培养皿:直径 90mm 。
2. 9  无菌锥形瓶:容量 250mL 、 500mL 。
2. 10 pH 计或精密
pH 试纸。
2. 11  无菌纸片:见 A. 8 。
2. 12  无菌镊子。
2. 13  游标卡尺:刻度为 0. 1mm 。
3  培养基和试剂
3. 1  胰蛋白胨大豆琼脂( TryptoneSoyAgar , TSA ):见 A. 1 。
3. 2  胰蛋白胨大豆肉汤( TryptoneSoyBroth , TSB ):见 A. 2 。
3. 3  平板计数琼脂( PlateCountAgar ):见 A. 3 。
3. 4 0. 1mol
/ LHCl :见 A.
4 。
3. 5  无菌生理盐水:见 A. 5 。
3. 6 50. 0 μ g / mL 环丙沙星( Ciprofloxacin , CIP )溶液:见 A. 6 。
3. 7 5. 0 μ g /片 环丙沙星纸片:见 A. 7 。
4  试验菌株
4. 1  金黄色葡萄球菌( Staphylococcusaureus ) ATCC6538 。
GB4789. 43 — 2016
2
4. 2  大肠埃希氏菌( Escherichiacoli ) ATCC11229 。
4. 3  蜡样芽胞杆菌( Bacilluscereus ) ATCC2 。
4. 4  环状芽孢杆菌( Bacilluscirculans ) ATCC4516 。
4. 5  化脓性链球菌( Streptococcuspyogenes ) ATCC12344 。
4. 6  粘质沙雷菌( Serratiamarcescens ) ATCC14041 。
5  检验程序
微生物源酶制剂抗菌活性的测定检验程序见图 1 。
图 1  微生物源酶制剂抗菌活性的测定检验程序
6  操作步骤
6. 1  试验菌悬液原液制备
将金黄色葡萄球菌( ATCC6538 )、大肠埃希氏菌(
ATCC11229 )、蜡样芽孢杆菌( ATCC2 )、环状芽
孢杆菌( ATCC4516 )、化脓性链球菌(
ATCC12344 )、粘质沙雷菌( ATCC14041 )冻存菌株分别接种于
GB4789. 43 — 2016
3
盛有 5mLTSB 的试管,置 36℃±1℃ 培养 18h~24h 进行第一次传代培养,分别挑取第一次传代培
养液 1~2 环转种于 5mLTSB 肉汤,置 36℃±1℃ 培养 18h~24h 进行二次传代培养,作为试验菌悬
液原液备用。
试验菌悬液原液纯度检测:分别挑取试验菌悬液原液各一环,划线接种于 TSA 平板, 36 ℃±1 ℃
培养 20h~24h ,观察纯度。
6. 2  菌悬液原液浓度测定
6. 2. 1  菌悬液原液稀释
分别取 6.
1 中制备的菌悬液原液依次进行十倍梯度稀释,蜡样芽孢杆菌和环状芽孢杆菌分别制成
10
-4 稀释液,金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、化脓性链球菌、粘质沙雷菌分别制成 10 -5 稀释液。
6. 2. 2  培养计数
分别吸取 6.
2. 1 中制备好的各菌稀释液 1mL 于无菌平皿内,每个稀释度做两个平行,并用无菌生
理盐水作空白对照。向平皿中倾注冷却至 46℃ 左右(可放置于 46℃±1℃ 的恒温水浴箱中保温)的平
板计数琼脂 15mL~20mL ,并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后,将平板翻转,于 36℃±1℃ 培
养 24h 后计数,各菌悬液原液中菌浓度均大于 10
6 CFU
/ mL 时方可使用。
6. 3  检测平板制备
倾注融化并冷却至 46℃±1℃ 的 TSA 培养基 15mL 于无菌培养皿内,待其凝固后制成 TSA 平
板,备用。
将 6.
1 中二次传代后的各菌培养物分别用冷却至 46℃±1℃ 的 TSA 培养基按 1∶10 的比例稀释
(其中化脓性链球菌 ATCC12344 按 1∶20 的比例稀释),充分混匀后各取 10mL 至上述已制备好、于
46℃±1℃ 中保温的 TSA 平板内,轻轻摇动平板使菌液均匀铺平,待其凝固后制成检测平板,备用。
注:为防止含菌培养基遇到 TSA 后马上凝固,引起菌悬液铺板不均匀,菌悬液铺板前应事先将 TSA 平板置于 46℃±
1℃ 条件下保温平衡 10min 。
6. 4  酶制剂纸片的制备
准确称(移)取 1.
0g ( mL )酶制剂于 9mL 无菌生理盐水中,充分混匀后制成
10% 的酶制剂溶液。
将无菌纸片放入无菌平皿内,在每张纸片上缓缓滴加 100 μ L10% 的酶制剂溶液,使其全部吸收,每种酶
制剂样品制备 12 张纸片。
6. 5  贴纸片及培养
将 6.
4 中制备的含待测酶制剂的纸片、含环丙沙星的阳性对照纸片(见 A. 7 )和含 100 μ L 无菌生理
盐水的空白阴性对照纸片用无菌镊子分别置 6.
3 中制备的检测平板上,每个平板贴 2 张纸片( 2 张含待
测酶制剂的纸片或 2 张含环丙沙星的纸片或 2 张空白纸片),两纸片圆点的间距大于 32mm ,每个标准
菌株分别设一阳性对照和一阴性对照平板。将平板正置于 4℃±0.
5℃ 冰箱内过夜( 12h~16h )。第
二天转入 36℃±1℃ 恒温培养箱中培养 24h 后,测定酶制剂样品、环丙沙星和阴性对照纸片形成的抑
菌圈。
7  抗菌活性结果报告
7. 1  结果判定
若待测酶制剂对 3 种或 3 种以上受试微生物呈现出抗菌活性,即纸片周围出现清晰可见的抑菌圈
GB4789. 43 — 2016
4
(每个抑菌圈直径 ≥16mm ),且阳性对照环丙沙星纸片对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、粘质沙雷菌、
环状芽孢杆菌、化脓性链球菌 5 种细菌形成的抑菌圈均 >16mm ,则判定该酶制剂样品中存在抗菌活性
物质。
7. 2  结果报告
报告样品中检出抗菌活性或未检出抗菌活性。
GB4789. 43 — 2016
5
附 录 A
培养基与试剂
A. 1  胰蛋白胨大豆琼脂( TryptoneSoyAgar , TSA )
A. 1. 1  成分
胰蛋白胨 15.
0g
大豆蛋白胨
5. 0g
氯化钠
5. 0g
琼脂粉
15. 0g
蒸馏水
1000mL
A. 1. 2  制法
将上述各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节
pH
至 7.
2±0. 2 ,分装至锥形瓶中, 121℃ 灭菌 15min 。
A. 2  胰蛋白胨大豆肉汤( TryptoneSoyBroth , TSB )
A. 2. 1  成分
胰蛋白胨
15. 0g
大豆蛋白胨
5. 0g
氯化钠
5. 0g
蒸馏水
1000mL
A. 2. 2  制法
将上述各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节
pH
至 7.
2±0. 2 ,分装试管, 121℃ 灭菌 15min 。
A. 3  平板计数琼脂( PlateCountAgar , PCA )
A. 3. 1  成分
胰蛋白胨
5. 0g
酵母浸膏
2. 5g
葡萄糖
1. 0g
琼脂
15. 0g
蒸馏水
1000mL
A. 3. 2  制法
上述各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节
pH
至 7.
2±0. 2 ,分装至锥形瓶中, 121℃ 灭菌 15min 。
GB4789. 43 — 2016
6
A. 4 0. 1mol
/ LHCl
A. 4. 1  成分
HCl 9mL
蒸馏水
991mL
A. 4. 2  制法
移取浓盐酸 9mL (质量浓度为 36% ,密度为 1.
17g
/ m
3 ),用无菌蒸馏水稀释至 1000mL ,
0. 22 μ m
微孔滤膜过滤除菌后备用。
A. 5  无菌生理盐水
A. 5. 1  成分
氯化钠
8. 5g
蒸馏水
1000mL
A. 5. 2  制法
称取 8.
5g 氯化钠溶于 1000mL
蒸馏水,
121℃ 灭菌 15min 。
A. 6 50. 0μg / mL 环丙沙星( Ciprofloxacin , CIP )
A. 6. 1  成分
1000 μ g / mL 环丙沙星 0. 5mL
无菌生理盐水
9. 5mL
A. 6. 2  制法
按产品说明书(百分比,含水量或效价)称取一定质量的环丙沙星用适量 0.
1mol
/ LHCl 溶解使其
浓度为 1000 μ g / mL ,无菌条件下 0.
22 μ m 微孔滤膜过滤后移取 0. 5mL ,用无菌生理盐水稀释至 10mL ,
混匀。
A. 7 5. 0μg /片环丙沙星纸片( Ciprofloxacinpaper , CIPpaper )
A. 7. 1  成分
50. 0 μ g / mL 环丙沙星 100 μ L
无菌纸片
1 张
A. 7. 2  制法
吸取 50.
0 μ g / mL 环丙沙星溶液 100 μ L 缓慢均匀滴加于无菌纸片上,制成 5. 0 μ g /片环丙沙星
纸片。
GB4789. 43 — 2016
7
A. 8  无菌纸片
A. 8. 1  要求
纸片外观应整洁、无毛边,无明显变形,无破损,
pH
为中性,厚度 0.
3mm~0. 6mm , 60s 内吸收 100 μ L
蒸馏水。
A. 8. 2  制备及储存方法
制成标准直径为 13.
0mm±0. 1mm 的圆形纸片,置玻璃容器内,密封, 121 ℃ 灭菌 15min 后,
80℃±5℃ 干燥 4h ,备用。