dm 活性炭内毒素方法验证

[所属分类:技术资料] [发布时间:2020-1-3] [发布人:] [阅读次数:] [返回]

山东拓普生物工程有限公司

Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd

审  批
	部门	姓名	签名	日期
起草人	质量检验部
审核人	质量检验部
审核人	品质管理部
审核人	品质管理部
批准人	质量负责人

 

分发部门：

  01品质管理部（1份）02质量检验部（1份）

共计2份

 

 

目 录

一、概述

二、验证目的与范围

三、验证方案编制依据

四、验证实施时间

五、验证成员和工作职责

六、验证前准备

七、验证内容与结果

八、漏项与偏差处理

九、评价与建议

十、验证结论

一、概述

活性炭（供注射用）是我公司生产制剂的常用辅料，现质量检验部依据《分析方法确认与验证管理规程》（文件编码：F0004-01）、《中国药典》2015版四部相关规定和相应指导原则、现行版GMP规范要求，对活性炭（供注射用）细菌内毒素检查法进行确认，证实该方法在现有实验室条件下检测数据的准确性和可靠性，以保证该辅料检验的顺利实施。

 

二、验证目的与范围

本次验证方案主要适用于活性炭（供注射用）质量控制所采用的细菌内毒素检查法的验证工作，目的在于考察所采用的检验方法在本实验室条件下的适用性。

 

三、验证方案编制依据

《分析方法确认与验证管理规程》（文件编码：F0004-01）、《中国药典》2015版四部、《药品GMP指南》之《质量控制实验室与物料系统》、《药品GMP验证指南》、《药品生产质量管理规范》2010年版

 

四、验证实施时间

预计实施时间：自      年    月    日开始至      年    月    日完成。

 

五、验证成员与工作职责

根据公司验证委员会要求，对具体验证项目成立专项验证工作小组，负责该项目验证方案的起草、审核/审阅、批准，并组织实施、协调，负责验证结果记录与评定，负责完成验证报告。

姓名	部门	工作职责
	质量检验部	负责起草验证文件
	质量检验部	负责审核验证文件，监督验证方案的实施
	品质管理部	负责相关文件的审核、归档，确保验证工作照章执行
	质量负责人	负责批准验证活动的执行

 

六、验证前准备

1 培训确认

 

序号	培训文件名称	编号	被培训人	培训方式	培训日期
1	《分析方法确认与验证管理规程》
2	《中国药典》2015版四部	——
3	细菌内毒素检查法标准操作规程	——

2 仪器与用具清单确认

设备名称	设备型号	设备编号	设备校验日期	有效期至
微型漩涡混合器
恒温试管加热仪
电热鼓风干燥箱

确认人/日期：                             复核人/日期：  

3 相关物料

试剂名称	批号	规格	生产厂家
鲎试剂(TAL)
鲎试剂(TAL)
细菌内毒素工作标准(WSE)
细菌内毒素工作标准(WSE)
细菌内毒素检查用水(BET)

确认人/日期：                             复核人/日期：

4 供试品品名：   活性炭    

  供试品批号：                         （以下分别简称试验组1，试验组2，试验组3）

 

七、验证内容与结果

1 细菌内毒素检验方法：

试验分为鲎试剂灵敏度复核试验、干扰预实验、干扰正式试验，供试品细菌内毒素检查试验。

1.1 鲎试剂灵敏度复核试验

用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品溶解，置漩涡混合器混合15min，等梯度制成2入、入、0.5入、0.25入，四个浓度（0.06EU/ml、0.03EU/ml、0.015EU/ml、0.0075 EU/ml），细菌内毒素溶液，按照《中国药典2015年版四部》通则1143(细菌内毒素检查法)检查由湛江博康海洋生物有限公司、湛江安度斯生物有限公司，生产的0.03EU/ml的鲎试剂，当最大浓度2入管均为阳性，最低浓度0.03入管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验有效。

细菌内毒素溶液具体稀释步骤如下：

1.1.1 80EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取细菌内毒素标准品1支，用75%酒精棉球毒

瓶颈，开启安瓿，加入BET水1.0ml, 用封口膜封口,置漩涡混合器混合15min，即得80EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.2 8EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取80EU/ml细菌内毒素溶液0.2ml,加1.8mlBET水,混合30s，即得8EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.3  1EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取8EU/ml细菌内毒素溶液0.3ml，加2.1mlBET水混合30s, 即得1EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.4  0.5EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取1EU/ml细菌内毒素溶液2ml，加BET水2ml混合30s, 即得0.5EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.5  0.25 EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取0.5EU/ml细菌内毒素溶液2ml，加2mlBET水混合30s, 即得0.25EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.6  0.06EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取0.25EU/ml细菌内毒素溶液0.5ml，加1.5mlBET水混合30s, 即得0.06EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.7  0.03EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取0.06EU/ml细菌内毒素溶液1ml，加1mlBET水混合30s, 即得0.03EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.8  0.015EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取0.03EU/ml细菌内毒素溶液1ml，加1mlBET水混合30s, 即得0.015EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.9  0.0075 EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取0.015EU/ml细菌内毒素溶液1ml，加1mlBET水混合30s, 即得0.015EU/ml细菌内毒素溶液。

1.1.10鲎试剂溶液的制备及加样：取0.1ml/支规格的鲎试剂18支，插在试管架上排成5列，其中前4列每列4支，第5列为2支，按标示量加入内毒素检查用水0.1ml复溶，然后从高到低依次加入0.1ml内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1mlBET水作为阴性对照，检查结果如表1。

鲎试剂灵敏度复核结果表1

鲎试剂厂家与批号	标示灵敏度 （入）EU/ml	内毒素浓度（EU/ml）																	灵敏度（入c）EU/ml
		0.06				0.03				0.015				0.0075				NC
湛江博康海洋 批号：	0.03
湛江安度斯 批号：	0.03
备注：阴性用“-”表示，阳性用“+”表示。

结果判断：                            

检查人/日期：                                                  复核人/日期：

1.2 干扰试验

供试品细菌内毒素本底值的确定：称取约75mg活性炭，加入约5ml细菌内毒素检查用水配制成活性炭浓度为1.5%（1.5g/100ml）的混合溶液，漩涡混合9min，然后1500s离心5min，离心后取上清液用0.22um无热源滤膜过滤，取续滤液按照通则1143检测，样品细菌内毒素应小于2EU/g。

供试品的最小稀释浓度，按《中国药典2015年版四部》通则1143细菌内毒素检查法中计算公式：计算最小有效稀释浓度c=入/L，供试品最小浓度0.015g/ml,并考虑到目前市售鲎试剂有0.5、0.25、0.125、0.06、0.03五个灵敏度，则有效稀释浓度为0.25g/ml～0.015g/ml

1.2.1 干扰试验预试验

      用BET水分别将活性炭各批样品分别稀释配制成浓度为0.015 g/ml、0.025g/ml、0.035g/ml、0.045g/ml,的系列稀释液（记为NPC管），另制备同样浓度的供试液，并使每一浓度的样品溶液均含有2入的内毒素（ 记为PPC管），选择两个不同生产厂家鲎试剂灵敏度为0.03EU/ml的鲎试剂，每一浓度分别取0.1ml，加入盛有0.1ml鲎试剂的试管中，每一浓度做2管，同时设阴性对照管（NC），阳性对照管（PC）,轻轻混匀，封口，按照《中国药典2015年版四部》通则1143(细菌内毒素检查法)依法检查结果见表2-1，表2-2。

供试液的制备具体步骤如下：

1.2.1.1  0.015g/ml： 取上清液用0.22um无热源滤膜过滤，取续滤液，备用。

1.2.1.2  0.025g/ml： 取0.015g/ml供试品溶液0.5ml，到0.3mlBET中，混匀，备用。

1.2.1.4  0.035mg/ml：取0.015g/ml供试品溶液0.5ml，到0.5mlBET中，混匀，备用。

1.2.1.5  0.045mg/ml：取0.015g/ml供试品溶液0.5ml，到1.0mlBET中，混匀，备用。

1.2.1.6  PPC溶液的制备：取0.06EU/ml细菌内毒素溶液0.3ml,加2倍各浓度下供试品0.3ml,混合30s，即得PPC溶液，备用。

活性炭干扰预试验结果表2-1

湛江博康海洋生物有限公司 批号：                入=0.03EU/ml
供试品			样品浓度（g/ml）				NC	PC
			0.015g/ml	0.025g/ml	0.035g/ml	0.045g/ml
试验组1	反 应 结 果	NPC
		PPC
试验组2		NPC
		PPC
试验组3		NPC
		PPC
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

结果判断：                                                                 

检查人/日期：                                                  复核人/日期：

活性炭干扰预试验结果表2-2

湛江安度斯海洋生物有限公司 批号：                入=0.03EU/ml
供试品			样品浓度（g/ml）				NC	PC
			0.015g/ml	0.025g/ml	0.035g/ml	0.045g/ml
试验组1	反 应 结 果	NPC
		PPC
试验组2		NPC
		PPC
试验组3		NPC
		PPC
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

结果判断：                                                               

检查人/日期：                                                  复核人/日期：

1.2.2 干扰试验正式试验

为了最终确定是否存在干扰因素，进行以下正式干扰实验。取活性炭用BET进行稀释，使其最终干扰实验浓度为0.015g/ml（鲎试剂0.03 EU/ml）按照《中国药典2015年版四部》通则1143(细菌内毒素检查法)中的“细菌内毒素检查供试品干扰试验”进行实验，结果见表3-1、3-2。

活性炭干扰试验正式试验结果 表3-1

湛江博康海洋生物有限公司 批号：                  入=0.03EU/ml
供试品		内毒素浓度（EU/ml）					Es(EU/ml)		Et（EU/ml）
		0.06	0.03	0.015	0.0075	NC
试验组1	反 应 结 果
试验组2
试验组3
BET水溶液
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

结果判断：                           

检查人/日期：                                                  复核人/日期：

活性炭干扰试验正式试验结果表3-2

湛江安度斯海洋生物有限公司 批号：                  入=0.03EU/ml
供试品		内毒素浓度（EU/ml）					Es(EU/ml)		Et（EU/ml）
		0.06	0.03	0.015	0.0075	NC
试验组1	反 应 结 果
试验组2
试验组3
BET水溶液
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

结果判断：                            

检查人/日期：                                                  复核人/日期：

1.3 供试品的细菌内毒素检查

1.3.1取本品用BET水制成0.015g/ml浓度稀释液，按照《中国药典2015年版四部》通则1143(细菌内毒素检查法)每1g活性炭中含细菌内毒素的量应小于2.0EU，结果见表4。

1.3.2可接受标准: 3批供试品管和阴性对照管均为阴性，供试品的阳性管及阳性对照管均为阳性。

供试品的细菌内毒素检查结果表4

湛江博康海洋生物有限公司 批号：                入=0.03EU/ml
供试品批号	供试品浓度	NPC	PPC	PC	NC
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

结果判断：                       

检查人/日期：                                                  复核人/日期：

2 活性炭对细菌内毒素吸附力

取细菌内毒素国家标准品1支，按使用说明书配制成浓度为200EU/ml，20EU/ml的标准内毒素溶液备用，称取约75mg活性炭， 两份，分别加入约5ml浓度为200EU/ml和20EU/ml的标准内毒素溶液配制成活性炭浓度为1.5%的混合溶液，漩涡混合9min，1500转离心5分钟，离心后，取上清液用0.22um无热源滤膜过滤，取续滤液按照通则1143检测结果见表5-6。

可接受标准：应能使200EU/ml，20EU/ml的标准内毒素溶液内毒素含量均下降2个数量级（吸附率达到99%）。

2.1细菌内毒素溶液具体稀释步骤如下：

2.1.1 取细菌内毒素标准品1支，用75%酒精棉球毒瓶颈，开启安瓿，加入BET水1.0ml, 用封口膜封口,置漩涡混合器混合15min，即得2000EU/ml细菌内毒素溶液。

2.1.2  200EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取2000EU/ml细菌内毒素溶液0.8ml,加7.2mlBET水,混合30s，即得200EU/ml细菌内毒素溶液。

2.1.3  20EU/ml细菌内毒素溶液制备方法：取200EU/ml细菌内毒素溶液0.8ml，加7.2mlBET水混合30s, 即得20EU/ml细菌内毒素溶液。

2.1.4  200EU/ml→2 EU/ml（下降2个log）供试品制备方法：取续滤液0.2ml，加1.4mlBET水混合30s，从混合液中再去0.5ml，加0.5ml BET水混合30s,备用。

2.1.5  20 EU/ml→0.2 EU/ml（下降2个log）供试品制备方法：取续滤液0.3ml，加0.6mlBET水混合30s，从混合液中再去0.5ml，加0.5ml BET水混合30s,备用。

2.1.6  PPC溶液的制备：取0.25EU/ml细菌内毒素溶液0.3ml,加2倍各浓度下供试品0.3ml,混合30s，即得PPC溶液，备用。

活性炭对细菌内毒素吸附力表5

湛江博康海洋生物有限公司 批号：                入=0.125EU/ml
供试品			细菌内毒素溶液浓度（EU/ml）		NC	PC
			200→2	20→0.2
试验组1	反 应 结 果	NPC
		PPC
试验组2		NPC
		PPC
试验组3		NPC
		PPC
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

结果判断：                           

检查人/日期：                                                  复核人/日期：

 

活性炭对细菌内毒素吸附力表6

湛江安度斯海洋生物有限公司 批号：                入=0.125EU/ml
供试品			细菌内毒素溶液浓度（EU/ml）		NC	PC
			200→2	20→0.2
试验组1	反 应 结 果	NPC
		PPC
试验组2		NPC
		PPC
试验组3		NPC
		PPC
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

结果判断：                           

检查人/日期：                                                  复核人/日期：

 

八、漏项与偏差处理

1、验证过程中未预计的问题、偏差、漏项，均应作为原始记录在记录中详细说明。

2、如有偏差或因故无法进行的试验，应进行分析，并有合理的解释说明。

3、当出现相关偏差时，由品质管理部经分析、确认偏差，执行偏差处理。

 

九、评价与建议

1、完成上述工作后，将结果整理汇总。以验证报告的形式来汇总验证的结果，并在报告中应按本方案加以核对和审查。审查的内容应包括

1.1检查主要的验证试验是否按计划完成。

1.2检查验证方案在实施过程中是否修改，修改的理由是否明确并有批准手续。

1.3重要试验结果的记录是否完整。

1.4验证结果是否符合设定的标准，对偏离标准的结果有否作过调查，是否需要进一步的补充试验。

2、拟订再验证周期：

当遇下列情况，应进行再验证（确认）。

2.1检验方法进行了修订。

2.2 制剂处方和工艺进行了变更。

2.3 当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

3、根据验证结果，确认该产品检验标准操作规程的适用性。

总结人：                       日期：

 

十、验证结论

批准人：                            日期：

十一、原始记录、图谱等附件