无菌检查操作规程

1. 目的

建立无菌检查标准操作规程，确保检查结果准确、可靠。

2. 使用范围

本公司无菌产品的无菌检查

3. 职责

质量部QC

4. 依据

2015版《中国药典》通则1101

GB/T 19973.2-2005（ISO11737-2:1998）
   《疗器械的灭菌 微生物学方法 第 2部分：确认灭菌过程的无菌试验》

GB/T 14233.2-2005
   《医用输液、输血、注射器具检验方法 第 2部分：生物学试验方法》

5. 内容

5.1. 无菌检查环境保障

5.1.1. 无菌检査的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，即无菌检査应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。

5.1.2. 操作环境的无菌保障程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可靠性，对洁净室（区）的环境定期监测并采取合理的措施保证洁净环境符合要求。

5.1.3. 无菌检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。

5.1.4. 洁净区的温度、湿度等参数必须符合相应洁净级别的要求。

5.1.5. 无菌检查操作还需要对检查环境进行监控，

5.2. 培养基、稀释液、缓冲液

5.2.1. 硫乙醇酸盐流体培养基，市售培养基干粉。除另有规定，接种后应置30~35℃培养。

5.2.2. 胰酪大豆胨液体培养基，市售培养基干粉。接种后应置20~35℃培养。

5.2.3. 中和或灭活用培养基，按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。

5.2.4. 胰酪大豆胨琼脂培养基，山东拓普生物培养基干粉。

5.2.5. 沙氏葡萄糖液体培养基，山东拓普生物培养基干粉。

5.2.6. 沙式葡萄糖琼脂培养基，山东拓普生物培养基干粉。

5.2.7. PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，山东拓普生物培养基干粉。

5.2.8. 0.9%无菌氯化钠溶液。

5.2.9. 培养基使用性检查

      无菌检査用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符培养基的无菌性检査及灵敏度检査的要求。本检查可在供试品的无菌检査或与供试品的无菌检査同时进行。

5.2.9.1.  无菌性检查：每批培养基随机取5支（瓶），按各培养基规定的温度下培养14天，应无菌生长。

5.2.9.2. 灵敏度检查

5.2.9.2.1. 菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代数不得超过5代(从菌种存中心获得的干菌种第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以证试验菌株的生物学特性 。

         金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]

         铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104]

         枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]

         生孢梭菌[CMCC(B)64 941]

         白色念珠菌[CMCC(F)98 001]

         黑曲霉[CMCC(F)98 003]

5.2.9.2.2. 菌液制备：接种金色葡萄球菌、铜绿假胞菌、枯草芽孢杆菌的培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30〜35℃培养18〜24小时；接种白色念珠菌的培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20〜25℃培养24〜48小时，上述培养后的新鲜培养物用PH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌化钠溶液制成每lml菌数小于100cfu(菌落形成）的菌悬液。接种黑曲霉的培养物至沙氏葡萄糖琼脂面培养基上，20〜25℃培养5〜7天，加人3〜5 ml 0.05%(ml/ml) 聚山梨酯80的pH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.05% (ml/ml)聚山梨醋80的pH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml孢子数量小于100cfu的孢子悬液。菌悬液若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2〜8 ℃在24h 内使用。黑曲霉孢子悬液存在2〜8℃，在验证过的贮存期内用。

5.2.9.2.3. 培养基接种：取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100cfu的色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100cfu的草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结。

5.2.9.2.4. 结果判定：空白管应无菌生长，加菌的管生长良好，说明该培养基灵敏度符合规定。

5.3. 方法试用性试验

进行产品无菌检查时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于产品的无菌检查。若检验程序或产品发生化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。方法适用性试验按“5.4供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行方法。

5.3.1. 菌种及菌液的制备：大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制同“5.2.9.2培养基灵敏度检查”。大肠埃希菌的菌液制同金黄色葡萄球菌。

5.3.2. 薄膜过滤法：每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu试验菌，过滤。加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度下培养，培养时间不得超过5天，各试验菌同法作。

5.3.3. 直接接种法：取符直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管，取符直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基6管，分别接入小于100cfu的枯草芽孢杆菌 、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作对照，置规定的温度培养，培养时间不得超过5天。

5.3.4. 结果判断：与对照管比较，如供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的检验量在检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检査方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的检验量在检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。

      方法适用性试验与供试品的无菌检查同时进行。

5.4. 供试品无菌检查

无菌检査法括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。

无菌试验过程中，若需用面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。

5.4.1. 检验数量：除另有规定外，按表1规定。

5.4.2. 检验量：即接种量，除另有规定外，按表2规定。

5.4.3. 阳性对照：应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰氏阳性菌为主的供试品，以金色葡萄球菌为对照菌；抗革兰氏阴性菌为主的供试品，以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制同“5.2.9.2培养基灵敏度检查”，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养72小时内应生长良好。

5.4.4. 阴性对照：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

5.4.5. 供试品的处理及接种培养基

操作时，用适宜的消毒液对供试品容器面进行彻消毒，如供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材(如带有除菌过滤的针头向容器内导入无菌空气，再按无菌操作启开容器取出内物。

5.4.5.1. 薄膜过滤法：薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤。无菌检査用的滤膜孔径应不大于0.45um，直径约50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。 

5.4.5.1.1. 水溶性供试品：水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤，以润湿滤膜。取规定量，直接过滤，或混至含不少于100ml适宜的稀释液的无菌容器中，混匀，立即过滤。如供试品有抑菌作用，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗数一般不少于3次（每滤膜每次冲洗量一般为100ml，且冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤），所用的冲洗量、冲洗方法同方法适用性试验中确定的。除生物制品外，一般样品冲洗后，1份滤器中加人100ml硫乙醇酸盐流体培养基，1份滤器中加入100ml胰酪大豆胨液体培养基。

5.4.5.1.2. 非水溶性供试品：取规定量，直接过滤；或混合溶于适量含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过滤。用含0.1%〜1 %聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少3次。加入含或不含聚山梨酯80的培养基。接种培养基照水溶液供试品项下的方法作。

5.4.5.1.3. 具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供试品：取规定量，每个最小装用50〜100ml冲洗液分别冲洗内壁，收集冲洗液于无菌容器中，然后照水溶液供试品项下方法作。同时应采用直接接种法进行装中所配带的针头、针管的无菌检査。

5.4.5.2. 直接接种法：直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检査的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养基接种的瓶或支数相同。除另有规定外，每个容器中培养基的用量不得大于接种到该容器中的供试品体积的10倍，同时，硫乙醇酸流体培养基每管装量不少于15ml，胰大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml。供试品检査时，培养基的用量和髙度同方法适用性试验中确定的。

5.4.5.2.1. 灭菌医用器具供试品：取规定量，必要时应将其拆散或切成小碎段，等量接种于各管以浸没供试品的适量培养基中。

5.4.6. 培养及观察：将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天；培养期间应逐日观察并记录是有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。

5.4.7. 结果判断

5.4.7.1. 阳性对照管应生长良好 ，阴性对照管无菌生长，供试品管都无菌生长，则供试品符合规定。

5.4.7.2. 阳性对照管应生长良好 ，阴性对照管无菌生长，供试品管中有任意一管有菌生长，则供试品不符合规定。

5.4.7.3. 阳性对照管应生长良好 ，阴性对照管无菌生长，供试品管浑浊，经确凿无菌生长，则供试品符合规定；经确证有菌生长，则供试品不符合规定。

5.4.7.4. 有以下情况的，判试验无效。

5.4.7.4.1. 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。

5.4.7.4.2. 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素，并且已经确证。

5.4.7.4.3. 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所用的物品和（或)无菌操作技术不当引起的。

5.4.7.5. 试验若经确认无效，则应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符规定；若有菌生长，判供试品不符规定。

6. 相关文件

《洁净区尘埃粒子监测操作规程》

《洁净区沉降菌监测操作规程》

《实验室洁净区清洁、消毒操作规程》

《洁净区环境监测管理规程》

《ZW型集菌仪使用、维护操作规程》

《SPX-150型生化培养箱使用、维护操作规程》

《MJK-150型霉菌培养箱使用、维护操作规程》

《SW-CJ系列洁净工作台使用、维护规程》

《阳性菌种管理规程》

7. 记录

《无菌检查原始记录》

 

 

 

附表：

表1：批出厂产品的最少检验数量

供试品	批产量	接种每种培养基的最少检验数量
医疗器具	≦100	10%或4件（取较多者）
	100<N≦500	10件
	＞500	2%或20件（取较少者）

注：表中最少检验数量不包括阳性对照用的供试品数量

 

表2：供试品的最少检验量

供试品	供试品装量	每支供试品接入每种培养基的最少量
医疗器具	外科用敷料棉花及纱布	取100mg或1×3cm
	缝合线、一次性医用材料	整个材料（注）
	带导管的一次医疗器具	二分之一内表面积
	其他医疗器具	整个器具（注）（切碎或拆散开）

注：如果医疗器械体积过大，培养基用量可再2000ml以上，将其整个完全浸没。

无菌检查原始记录（薄膜过滤法）

                                                     检验编号：

产品名称

型号规格

产品数量

产品批号

灭菌批号

灭菌有效期

来源

检品数量

检验日期

年  月  日

完成日期

年  月  日

检验依据

《无菌检查标准操作规程》

检验结果

培养基：        硫乙醇酸盐流体培养基    配制批号：                                       胰酪大豆胨液体培养基    配制批号：                       稀释液、冲洗液：□0.1%蛋白胨水溶液   □PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液   □0.9%无菌氯化钠溶液 □其他                  配制批号：                       阳性对照菌菌液：取对照菌新鲜培养物，接种至适量的0.9%无菌氯化钠溶液中，取1ml进行10倍系列稀释，取稀释液作为对照菌液。 对照菌名称：                     代数：              计数结果：           cfu/ml 仪器设备：□ZW-808A型集菌仪      仪器编号：                                   □MJX-150霉菌培养箱 （20~25℃）   仪器编号：                                 □SPX-150生化培养箱 （30~35℃）  仪器编号：                       无菌集菌器：批号：                       生产厂家：

净化工作台环境监测  温度：     ℃ 湿度：    %  沉降菌标准（培养温度：30~35℃）：<1cfu/皿

碟号 培养时间

1

2

3

结果判断

培养48h菌落数

培养天数 培养基

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

硫乙醇酸盐流体培养基（30~35℃）

样品

阳性

阴性

胰酪大豆胨液体培养基（20~25℃）

样品

阴性

注：逐日观察，集菌器中有菌生长则填“+”，无菌生长则填“-”

结果判定：本品按《无菌检查标准操作规程》依法检查，结果

检验人/日期：                                  复核人/日期：