活菌培养计数技术

[所属分类:技术资料] [发布时间:2018-9-18] [发布人:管理员] [阅读次数:] [返回]

2.1.1.3 活菌培养计数技术

2.1.1.3.1 适用范围

测定细菌悬液、菌片、采样液等样本中含有活菌的数量。

2.1.1.3.2 试验器材

（1）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。

（2）稀释液：见附录A。（无菌蒸馏水）浸泡5分钟左右，震敲直至看到滤纸边缘分层

（3）营养琼脂培养基：见附录A。

（4）电动混合器

2.1.1.3.3 操作程序

本规范要求在杀菌试验中的活菌培养计数统一使用倾注法。其操作程序如下。

（1）对菌悬液可直接进行培养计数。对菌片、采样棉拭与小型固体样本等，应将其上的细菌洗下成为菌悬液后进行培养计数。洗菌时，一般以稀释液为洗液。具体方法如下: 取含 5.0ml 稀释液无菌试管，对菌片或小型固体样本直接投入即可，对棉拭则将其采样端剪入管内，每管一份样本。而后，用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80 次），将菌洗下形成菌悬液。以上操作应严格按无菌要求进行。

（2）将试管按需要数量分组排列于试管架上， 每管加入 4.5ml 稀释液。各组由左向右，逐管标上 10^-1、10^-2、10^-3......等。

（3）将菌悬液样本在用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），随即吸取 0.5ml加至 10^-1 管内。

（4）将 10^-1 管依前法用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），混匀，再吸取出0.5ml加入10^-2 管内。如此类推，直至最后一管。必要时，还可作某稀释度的1:1或1:4稀释。

（5）选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为 15cfu～300cfu 者为宜），吸取其中混合均匀的悬液 1.0ml 加于无菌平皿内。每一稀释度接种 3个平皿。一般需接种2个～3个不同稀释度。平皿加样前，应先按组编号，以免弄混。

（6）将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿15ml～20ml。

（7）将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放于台上。待琼脂凝固后，翻转平皿，使底向上，置37℃温箱内培养。

（8）每日观察细菌生长情况。培养至规定时间（细菌繁殖体为 48h，白色念珠菌与细菌芽孢为 72h），计数最终结果的菌落数。

（9）对菌片和采样棉拭洗液的活菌培养计数，先按各试验要求处理（如去除残留消毒剂等），而后取其最终样液按上法进行培养计数。

（10）计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu～300cfu的平板为准，每个稀释度 3 个平板生长菌落数全合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合上述标准，则以该合格的两个平板菌落的平均值为结果。但对黑曲霉菌活菌计数及杀灭试验时，平板菌落数应在15cfu～100cfu之间。

对估计菌量极少的样本（如消毒处理后样本），在培养计数时可不作稀释，即使平板菌落数未达15时，亦可用其计算最终结果。

将求得的平均菌落值，再乘以稀释倍数，即得每毫升原样液中的菌量。菌量单位为cfu。

2.1.1.3.4 活菌计数中技术操作误差的测定

试验者在活菌计数中因技术操作而引起的菌落数误差率（平板间、稀释度间）不宜超过10%。对误差率的自检，可按以下公式计算。

（1）平板间误差率计算公式：

（2）稀释度间误差率计算公式：

 

2.1.1.3.5 注意事项

（1）严格无菌操作，防止污染。

（2）认真检查试验器材有无破损（要特别注意试管底的裂痕和破洞），以防丢失样本和污染环境。

（3）注意菌液的均匀分散。

（4）稀释或取液时要准确，尽量减少吸管使用中产生的误差。

（5）每吸取一个稀释度样液，必须更换一支吸管，以减少误差。

（6）样液接种于平皿后应尽快倾注营养琼脂培养基，避免样液干燥于平皿上，影响结果的准确性。

（7）倾注时琼脂培养基温度不得超过45℃，以防损伤细菌或真菌。倾注和摇动时，动作应尽量平稳，以利细菌分散均匀，便于计数菌落。勿使培养基外溢，以免影响结果的准确性和造成环境的污染。

（8）为提高试验成功率，最好先用浊度计对原菌液含菌量做出估计，尽可能在首次试验时所取的有限稀释范围内（2个～3个 稀释度）即有长菌在 15cfu～300cfu 之间的平板。

（9）结果计算时，必须弄清稀释倍数，以免计算错误。