Table of Contents
目录
1. PURPOSE 目的 3
2. SCOPE 范围 3
3. REFERENCE 参考资料 3
4. DEFINITIONS 定义 3
5. AUTHORITY/RESPONSIBILITY 权责 3
6. PROCEDURE 程序 3
7. RELATED DOCUMENTS 相关文件: 9
8. RELATED RECORDS 相关记录: 9
9. REVISON RECORDS 修订记录: 9
10. ATTACHMENT 附件: 10
1. PURPOSE
目的
本程序旨在阐明微生物实验结果的鉴别程序和操作规范，确保鉴别结果的准确性和可靠性。
2. SCOPE
范围
所有用于检测的以及在检测中发现的微生物，包括细菌（需氧菌、厌氧菌）、酵母菌和霉菌。
3. REFERENCE
参考资料
产品说明书
4. DEFINITIONS
定义
不适用
5. AUTHORITY/RESPONSIBILITY
权责
5.1 QC主管有责任保证此程序的执行。
5.2 实验室所有微生物人员有责任严格按此程序执行。
6. PROCEDURE
程序
6.1 方法分类
微生物实验结果的鉴别方法分为：菌落形态检查、显微镜检查、基础生化试验鉴别、API鉴别。其中API是建立在生化鉴别试验基础上的一种简便、快捷的鉴别方式。
6.2 方法选择
微生物鉴别是微生物实验室重要的步骤之一，同时也是物料释放的主要参考依据，因此微生物鉴别方法的选择和具体的鉴别操作必须严格按照相应的标准操作程序执行，从而保证鉴别结果的可靠性。在无明确规定的情况下，首先应当依次进行菌落形态检查和显微镜检查以确认微生物的大类，然后根据初步确认结果选择合适的API系统进行鉴定，必要时进行基础生化试验鉴别以辅助确认微生物种类。
6.3 鉴别步骤
6.3.1 菌落形态检查
菌落形态检查主要采用肉眼直接对有形的菌落形态进行辨识，主要包括菌落大小、颜色、菌落表面光滑度和菌落外形等，必要时可以借助放大镜。
6.3.2 显微镜检查
6.3.2.1 划线分离
将待鉴定微生物从它生长的培养基上分离成纯的、单细胞菌落以保证该菌种的纯度。
ü 对于在检测中发现的未知微生物，采用无菌接种环或针挑取可疑菌落，用分区划线法（图1）在TSA或SDA或R2A平板上划线分离。
TSA平板于30-35℃培养18-24小时；SDA平板于30-35℃或20-25℃培养18-72小时；R2A平板于30-35℃培养18-24小时；若在上述培养时间内未能生长，可适当延长培养时间或更换培养基或采用厌氧培养。
ü 对于用于检测的已知微生物，除特殊要求的以外，培养要求如下：
使用API鉴别，细菌接种在TSA平板上并于30-35℃培养18-24小时；酵母菌接种在SDA平板上并于30-35℃或20-25℃培养18-72小时。
6.3.2.2 染色
为了更好的在显微水平下对微生物的个体形态进行观察，适当的染色十分必要，适用的方法主要有革兰氏染色、芽孢染色和霉菌染色等。
ü 镜检的主要内容包括微生物的细胞形状、大小和着色状况等。
ü 细胞形状主要有杆菌（包括球杆菌、长杆菌和短杆菌等）、球菌（包括双球菌、葡萄球菌和链球菌等）、螺旋菌、弧菌、是否有孢子、酵母和霉菌等。
ü 着色类别以革兰氏染色为例，主要有革兰氏阴性和革兰氏阳性等。
6.3.3 基础生化鉴别
6.3.3.1 过氧化氢酶试验
ü 滴加过氧化氢酶至单个菌落上。
ü 在60秒内出现气泡，表明结果为阳性，否则为阴性。
6.3.3.2 氧化酶试验
ü 氧化酶试剂：滴加氧化酶试剂置单个菌落上。
ü 氧化酶试剂条：挑取单个菌落置试剂条上。
ü 在20秒内出现蓝黑色，表明结果为阳性，否则为阴性。
6.3.4 API鉴别系统
6.3.4.1 API鉴别主要包括API20NE、API20E、API Staph、API20 Strep、API50CH等。有关各种API鉴别的方法参见相应的标准操作程序和使用说明书。
6.3.4.2 依据6.3.3.1~6.3.3.2得出的待检菌落的初步鉴定结果，按照目标微生物的个体细胞形态分别进行鉴别，具体参见表1“微生物分类鉴别表”。
6.3.4.3 API鉴别流程参见 “API鉴别系统试剂条选择流程图”。
6.3.5 微生物分类鉴别
6.3.5.1 分类鉴别表
表1：微生物分类鉴别表
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分类
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镜检形态
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基础生化实验
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API
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VITEK 2
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球菌
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球状，绝大多数为革兰氏染色阳性
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过氧化氢酶
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阳性
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API Staph
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GP
|
|
阴性
|
API Strep
|
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血琼脂
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生长
|
API Staph
|
|
血浆凝固酶
|
阳性
|
API Staph
|
|
阴性
|
API Staph
|
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杆菌
|
革兰氏染色阳性
|
过氧化氢酶
无孢子
|
阳性
|
API Coryne
API Listeria
|
ANC
|
|
阴性
|
API 50 CHL
|
|
有孢子，好氧过氧化氢酶
|
阳性
|
API 50 CHB/E
|
BCL
|
|
有孢子，厌氧
|
N/A
|
API 20A
|
ANC
|
|
革兰氏染色阴性
|
无孢子，好氧氧化酶
|
阳性
|
API 20NE
|
GN
|
|
阴性
|
API 20E
|
|
酵母
|
球型，细胞体积明显大于细菌，革兰氏染色阳性
|
N/A
|
N/A
|
API C AUX
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YST
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6.3.5.2 霉菌特征与分类
表2霉菌特征与分类
|
霉菌分类（属）
|
菌落形态特征
|
镜下形态特征
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|
毛霉
|
菌落呈蔓延式生长，但初期可成菌落状；
菌落形态为稀疏絮状；
菌丝体灰白色、灰褐色、色泽先出现于菌落中心。
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菌丝无隔、多核、分枝状，无假根或匍匐菌丝，菌丝体上直接生出孢囊梗，孢子囊，无囊托。
|
|
曲霉
|
颜色是白灰色到黑色（黄色或橙色/绿色/褐色或似褐色）；
有典型的曲霉菌头。
|
分生孢子梗由一根直立的菌丝形成，菌丝的末端形成球状膨胀（顶囊），分生孢子。
|
|
青霉
|
颜色是绿色到似绿色；
典型的毛刷般结构；
孢子：有时形成链条。
|
菌丝有横隔、分生孢子梗、帚状枝、分生孢子。
|
|
根霉
|
表面广泛蔓延，不产生定形菌落，白色到黑色绒毛状。
|
菌丝无隔、多核、分枝状，有匍匐菌丝和假根，假根上方长出一至数根孢囊梗，顶端长球形孢子囊。
|
6.3.6 结果的报告
经过一系列鉴别工作之后，待检菌落可以通过API鉴别确认到属或种，同时鉴别结果必须达到以下鉴别确认标准后方可作为鉴别结果进行报告。
l 产品、原辅料、水、环境中分离的微生物 ≥85%， 即鉴别评语至少在“可接受的鉴别”以上。
l 标准菌种、工作菌种 ≥95%， 即鉴别评语至少在“非常好的鉴别”以上。
l 鉴定结果评价表
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评语
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鉴定结果数目
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可信性（%）
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说明
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极好的鉴别
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1
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96~99
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N/A
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非常好的鉴别
|
1
|
93~95
|
N/A
|
|
好的鉴别
|
1
|
89~92
|
N/A
|
|
可接受的鉴别
|
1
|
85~88
|
N/A
|
|
低分辨率的
|
2~3
|
每个选择可能性的总和=100；
VITEK 2 Compact 决定一种选择后，百分数代表了选择结果的出现概率。
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2至3个分类具有相同的生物型，通过补充试验区分它们。
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|
不能鉴定
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>3
|
N/A
|
3种以上的分类具有相同的生物型
|
|
0
|
非常不典型的生物型。与数据库中任何分类都不一致。需检查革兰氏染色和菌种纯度。
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6.3.7 重新鉴别
当API鉴别结果是“可疑的鉴别结果”、“低分辨率的”、或“不可接受鉴别结果”、“不能鉴定”时，在报告实验室主管后，需要重新进行鉴别。如果重新鉴别结果证实了初始鉴别结果，API鉴别结果不能作为报告依据，如果重新试验结果未证实初始鉴别结果，则按重新鉴别的结果报告。
6.4 实验操作步骤
6.4.1 革兰氏染色法
6.4.1.1 材料
|
革兰氏染色剂
|
商业购买
|
R1: 草酸盐 - 结晶紫溶液
R2: 稳定化卢哥氏 - PVP液
R3: 脱色剂
R4: 番红液
|
|
自行配制
|
结晶紫；革兰氏碘；去色剂（乙醇：丙酮 = 4：1）；沙黄
|
6.4.1.2 方法
6.4.1.3 涂片和固定
1) 用接种环或接种针取微生物于载玻片上的纯水滴中，涂匀，使载玻片上形成薄薄的微生物水层。加热固定载玻片上的微生物涂片，然后冷却。注意涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热，以玻片不烫手为宜。
6.4.1.4 染色
1) 初染：用R1或结晶紫染色1分钟，水洗。
2) 媒染：用R2或革兰氏碘染色1分钟，水洗。
3) 脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，用R3或去色剂冲洗至不再流出紫色即可，立即水洗。
4) 复染：用R4或沙黄复染1分钟，水洗。自然干燥后镜检。
6.4.1.5 染色结果判断
1) 革兰氏阳性菌 --- 紫色到蓝色的细胞
2) 革兰氏阴性菌 --- 粉红到红色的细胞
6.4.2 3%KOH 法
l 在干净的载玻片上滴加1滴3%KOH；
l 从固体培养基上用接种环挑取一较大的菌落，把菌放到3%KOH液滴上；
l 用接种环在载玻片在此液滴上研磨10~15s；
l 将接种环轻轻提起，进行观察，在60s内出现细丝者为拉丝反应阳性，则该菌为革兰氏阴性菌；在60s内不出现细丝者为拉丝反应阴性，则该菌为革兰氏阳性菌；
6.4.3 芽孢染色
6.4.3.1 材料
1) 0.5%番红水溶液
2) 5%孔雀绿水溶液
6.4.3.2 方法
1) 涂片、干燥、固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2—3次。
2) 染色：
i 加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5-10min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。
ii 水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。
iii 复染：用蕃红液染色1-2min。
iv 水洗、晾干或吸干。
v 镜检： 观察芽孢（菌体）颜色、形状、着生位置、芽孢囊特征等。
6.4.3.3 染色结果
1) 芽孢是绿色的；
2) 细胞是红色的
6.4.4 霉菌染色（透明胶带法）
6.4.4.1 材料 乳酚蓝液染色剂
6.4.4.2 方法（见图2）
1) 在载玻片上滴加一滴乳酚蓝液染色剂；
2) 食指与拇指黏在一段透明胶带两端，使胶带呈U形，胶面朝下；
3) 胶面轻触霉菌表面；
4) 将黏在胶面的菌体侵入载玻片上的乳酚蓝液染色剂中，并将胶带两端固定在载玻片两端
5) 先低倍镜、再高倍镜观察。
注意：菌丝不要黏得太厚，否则不利于显微镜观察。
6.4.4.3 结果判断
6.4.4.4 菌落形态特征和镜下形态特征与表2“霉菌特征与分类”比较，得出鉴别结果。
6.5 细菌形态特性表
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分类
|
项目
|
具体描述
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|
形态与染色
|
染色性
|
革兰氏阳性、阴性
|
|
形状、大小和排列
|
球菌、杆菌或螺行菌，菌体大小，单个、成双、短链、葡萄状等。
|
|
细菌的特殊结构
|
芽孢的大小、位置，鞭毛数目及位置等。
|
|
菌落特征
|
大小
|
以毫米计，一般分为大（>3mm），中（2~3mm），小（<2mm）
|
|
表面
|
粗糙、光滑、粘液样、皱纹、放射状、同心圆等。
|
|
透明度
|
透明、、半透明、不透明。
|
|
外形
|
圆形、不规则、跟茎状、阿米巴状、卷发状、菌丝状、念珠状等。
|
|
颜色
|
黄色、白色、乳白色、红色等
|
|
高度
|
扁平、凸起、隆起、脐形、纽扣形、针尖形等。
|
|
边缘
|
整齐、锯齿状、叶状、细毛状、散状、破裂状、树枝状等。
|
|
光泽
|
光泽、无光泽、荧光等。
|
|
硬度
|
用接种环呈粘稠状或易碎等。
|
6.6 细菌培养特性
6.6.1 细菌培养特性表
|
培养特性
|
营养要求
|
简单或复杂
|
|
生长速度
|
快或慢
|
|
气体环境
|
需氧、兼性厌氧或厌氧
|
|
适应生长温度
|
10℃、25℃、35~37℃或45℃。
|
6.6.2 微生物鉴别过程中需要综合考虑各种因素。在判断细菌的革兰氏阴性或阳性时，需要综合考虑革兰氏染色结果、3%KOH拉丝结果、能否在MCA平板上生长、以及在其它培养基上生长状况。例如：在水系统中常见的甲基杆菌（Methylobacterium spp.）革兰氏染色结果为阴性、3%KOH拉丝结果为阴性、能在MCA平板上生长，在TSA上生长缓慢，在R2A平板上生长较快，菌落为红色、凸起、光滑、直径1~2mm，革兰氏染色镜检为：红色短杆状，菌体两端有圆形气泡。综合以上因素判断，甲基杆菌（Methylobacterium spp.）为革兰氏阴性杆菌。
6.7 《API鉴别系统试剂条选择流程图》
7. RELATED DOCUMENTS
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8. RELATED RECORDS
相关记录:
8.1 FQC-TSM-048-01-01 微生物鉴别记录
9. REVISON RECORDS
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